拮抗丁香假單胞菌海洋微生物的篩選與鑒定

黃楊竹，石悅煒，宋紅麗，何鑫穎，李相達，趙敬哲，金黎明

（大連民族大學 生物技術與資源利用教育部重點實驗室，遼寧 大連 116600）

丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）是一種革蘭氏陰性、好氧的半活體營養菌[1]，因首次是從丁香樹中分離得到而被命名為丁香假單胞菌[2]。該菌根據宿主特異性、侵染癥狀和生理生化特點劃分為50多個病原菌[3]，寄生生長于180多種不同宿主體內。此菌可以引起核桃葉片呈斑點狀壞死[4]、中華芒草[5]和金菊[6]的細菌性枯萎病、黃瓜角斑病[7]、葡萄花序和漿果腐爛[8]、獼猴桃[9]和櫻桃[10]細菌性潰瘍病，同時也能感染桑葚、杏、李、番茄、大豆、擬南芥等植物致病[11]。丁香假單胞菌可以通過植物組織碎片進行傳播，能夠附著在植物葉片表面生長，也能借植物氣孔和下裂孔的自然開口或機械傷口進入植物內部[12]。因此，丁香假單胞菌是一種重要的植物致病菌，已被當做了解植物疾病的模式生物[13]。

因生長環境特殊，海洋微生物具有獨特的生存策略，它們所產生的罕見代謝產物可能成為它們的生存優勢，目前對海洋微生物資源的探索和次級代謝產物的研究已經成為熱點之一[14]。如羅曼等[15]從南極沉積物樣品中分離純化出一株枯草芽孢桿菌斯氏亞種（Bacillus subtilissubsp.spizizenii），對植物致病菌如層生鐮刀菌（Fusarium proliferatum）有較強抑制效果。深海來源的芽孢桿菌屬物種因能產生大量酶和抗生素等，而被許多學者看作是優質益生菌[16]。ZHOU Y等[17]從南大西洋的深海沉積物中分離篩選得到一株能抑制曲霉突變株菌絲生長的環狀芽孢桿菌（Bacillus circulans），且該菌對黃曲霉毒素前體的積累有阻礙作用。LI W等[18]研究發現，太平洋來源的深海微生物B5，可以產生抗茶擬盤多毛孢（Pseudopestalotiopsis theae）和茶炭疽病菌的活性物質。

本研究以生物抗菌活性為導向，從印度洋沉積物樣品中分離純化并篩選出能夠抑制丁香假單胞菌生長的菌株，采用形態觀察、生理生化實驗及16S rDNA基因序列分析對其進行菌種鑒定，并對其抑菌廣譜性進行研究，為后期從中探索得到高效力抗菌活性物研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

樣品為自然資源部第三海洋研究所提供的西南印度洋沉積物（水深1 783 m）。

1.1.2 菌株

丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）BNCC 134219、大腸桿菌（Escherichia coli）CMCC 44102、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticu）CGMCC 1.1616、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）CICC 21484、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）BNCC 194496、屎腸球菌（Enterococcus faecium）BNCC 336951、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）BNCC 186113、白色念珠菌（Candida albicans）CMCC 52201：本實驗室保藏。

1.1.3 培養基

營養肉湯（nutrient broth，NB）培養基[19]：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，去離子水1 000 mL，pH=7.0。營養瓊脂培養基：在此基礎上加入瓊脂30 g/L。

LB海水培養基[19]：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母提取物5 g，海水1 000 mL。

LA海水培養基[19]：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母提取物5 g，瓊脂20 g，海水1 000 mL。

葡萄糖蛋白胨酵母膏（glucose peptone yeast extract，GPY）海水培養基[20]：蛋白胨2 g，酵母膏0.5 g，葡萄糖10 g，瓊脂20 g，海水1 000 mL。

2216E海水培養基[21]：蛋白胨5 g，酵母膏1 g，磷酸鐵0.1 g，瓊脂20 g，海水1 000 mL。

腦心浸出肉湯（brainheartinfusionbroth，BHI）培養基[19]：蛋白胨10 g，脫水小牛腦浸粉12.5 g，脫水牛心浸粉5 g，NaCl 5g，葡萄糖2g，磷酸氫二鈉2.5g，瓊脂20g，去離子水1000mL。

MRS培養基[19]：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉浸粉20 g、吐溫80 1 g、檸檬酸氫二銨2 g、乙酸鈉5 g、磷酸氫二鉀2 g、硫酸鎂0.2 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL。

以上培養基均在121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.1.4 試劑

瓊脂（生化試劑）：廣州賽國生物科技有限公司；氯化鈉（分析純）、酵母提取物（生化試劑）、葡萄糖（分析純）、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物、SanPrep柱式脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）膠回收試劑盒：生工生物工程（上海）有限公司；胰蛋白胨（生化試劑）、瓊脂糖（分析純）：奧博星生物技術有限公司。其他試劑均為國產分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設備

HVE-50高壓滅菌器：日本HIRAYAMA公司；BSA224S電子天平：德國Sartorius公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺：日本Airtech公司；SPX培養箱：寧波東南儀器有限公司；RV10旋轉蒸發儀：德國IKA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 海洋微生物的分離及純化

采用涂布平板法和平板劃線法[19]分離印度洋沉積物中的微生物，取1 g樣品加入9 mL經過滅菌的60%的海水中，振蕩2 h后靜置，按10倍梯度依次稀釋至10-7。取稀釋度為10-7、10-6、10-5的樣品各50 μL均勻涂布于LA海水培養基、2216E培養基、GPY培養基，置于28 ℃培養箱中恒溫培養3 d。選取形態不同的微生物反復平板劃線，得到純化后的單菌落，37 ℃搖瓶培養24 h后與甘油混合，編號保存于-80 ℃冰箱中。

1.3.2 丁香假單胞菌拮抗菌株的篩選

將丁香假單胞菌以1%（V/V）的接種量接種于營養肉湯培養基中活化，30 ℃搖床培養2 d。再將分離得到海洋微生物以0.1%（V/V）的接種量接種于LB海水培養基中，37 ℃、180 r/min條件下培養24 h，即得到海洋微生物種子液。

初篩：采用濾紙片法[22]。在無菌條件下，吸取活化后的丁香假單胞菌100 μL均勻涂布于營養瓊脂培養基上。在每種海洋微生物種子液中各放入5片直徑為9 mm的濾紙圓片，浸泡10 min后整齊疊放在上述營養瓊脂培養基上，30 ℃培養24 h，觀察是否出現抑菌圈。

復篩：采用牛津杯法[23]。首先以0.1%（V/V）的接種量將分離得到的海洋微生物接種于LB海水培養基中，37 ℃、180 r/min條件下培養24 h。將得到的菌株發酵液在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，取其上清液旋轉濃縮100倍，并通過0.22 μm的無菌微孔濾膜過濾后放到無菌離心管中。吸取活化后的丁香假單胞菌100 μL均勻涂布于營養瓊脂培養基上，在此基礎上放置牛津杯，杯內加入200 μL濃縮的海洋微生物發酵液，于30 ℃條件下培養24 h，采用游標卡尺測定透明圈直徑，抑菌圈直徑＜10 mm屬于低度敏感，10～15 mm屬于中度敏感[24]。

1.3.3 丁香假單胞菌拮抗菌株的鑒定

（1）形態觀察及生理生化實驗

將篩選得到的丁香假單胞菌拮抗菌株劃線接種于LA海水培養基中，觀察其形態特點，再根據《常見細菌系統鑒定手冊》[25]對其生理生化特征進行鑒定，包括革蘭氏染色、糖發酵試驗、吲哚試驗等。

（2）分子生物學鑒定

選取通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-AAGTCGTAACAAGGTAACG-3'），采用菌落PCR的方法對篩選得到的丁香假單胞菌拮抗菌株的16S rDNA基因序列進行擴增。PCR擴增體系：模板7 μL，細菌通用引物27F和1492R 各2 μL，2×TaqPlus Master Mix酶25 μL，雙蒸水（dd H2O）14 μL，總體積為50 μL；PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；98 ℃變性30 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，共30個循環；72 ℃再延伸5 min。

將PCR擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性搜索比對，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA 6.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法繪制系統發育樹。

1.3.4 抑菌譜研究

采用瓊脂擴散法探究菌株濃縮發酵液對各種致病菌的抑制效果[26]。鮑曼不動桿菌使用BHI培養基、肺炎克雷伯菌使用NB培養基、屎腸球菌使用MRS培養基，其他致病菌均使用LB培養基。

首先以0.1%（V/V）的接種量將篩選得到的海洋微生物接種于LB海水培養基中，37 ℃、180 r/min條件下搖床培養24 h。將得到的菌株發酵液在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，取其上清液旋轉濃縮100倍，并通過0.22 μm的無菌微孔濾膜過濾后放到無菌離心管中。取37 ℃培養了12 h的致病菌種子液100 μL，與55 ℃左右相應的40 mL瓊脂培養基混勻，倒平板，凝固后用直徑為12 mm的打孔器打孔，并加入300 μL濃縮發酵液，三份平行，37 ℃條件下培養12 h后觀察結果。

2 結果與分析

2.1 海洋微生物的分離純化

從印度洋沉積物樣品中共分離得到115株海洋微生物。

2.2 丁香假單胞菌拮抗菌株的篩選

2.2.1 初篩結果

以丁香假單胞菌為指示菌，用濾紙片法進行初篩，篩選得到33株具有拮抗效果的菌株，其中8株菌株的抑菌效果較好。

2.2.2 復篩結果

采用牛津杯法對8株抑菌效果較好的菌株進行復篩，結果見表1。由表1可知，菌株NO.4.1.3-1的抑菌圈直徑最大，達到（12.63±0.06）mm，其抑菌效果見圖1。

表1 丁香假單胞菌拮抗菌株的復篩結果Table 1 Re-screening results of antagonistic strains of Pseudomonas syringae

圖1 菌株NO.4.1.3-1對丁香假單胞菌的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of strain NO.4.1.3-1 on Pseudomonas syringae

2.3 菌株NO.4.1.3-1的鑒定

2.3.1 形態觀察

菌株NO.4.1.3-1的菌落及細胞形態見圖2。由圖2可知，菌株NO.4.1.3-1在LA海水培養基上呈不透明乳白色菌落，邊緣不規則且不整齊，質地粘稠，培養1 d后單菌落出現褶皺。其鏡檢結果為革蘭氏陽性菌，菌體為桿狀。

圖2 菌株NO.4.1.3-1的形態學特征Fig.2 Morphological characteristics of strain NO.4.1.3-1

2.3.2 生理生化實驗結果

菌株NO.4.1.3-1的生理生化試驗結果見表2。由表2可知，菌株NO.4.1.3-1能分解葡萄糖產酸且不產氣，能使明膠液化，能產生過氧化氫酶，甲基紅試驗、V-P試驗、淀粉水解試驗、尿素試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗、檸檬酸鹽試驗結果均為陽性。

表2 菌株NO.4.1.3-1的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain NO.4.1.3-1

2.3.3 16S rDNA序列分析及系統發育樹的構建

菌株NO.4.1.3-1的16S rDNA基因序列的PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖3。由圖3可知，在1 700 bp左右出現目的條帶，符合預期結果，說明PCR成功擴增出了目標序列。

圖3 菌株NO.4.1.3-1 16S rDNA基因序列PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.3 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplification product of 16S rDNA sequence of strain NO.4.1.3-1

基于16S rDNA基因序列構建菌菌株NO.4.1.3-1的系統發育樹，結果見圖4。由圖4可知，菌株NO.4.1.3-1與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）聚在同一分支，親緣關系最為接近，結合形態觀察及生理生化特征，最終將該菌株鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。貝萊斯芽孢桿菌因其能產生多種抗菌代謝物（聚酮類[27]、脂肽類[28]及抗菌蛋白[29]）而被得到廣泛認可[30]，并廣泛應用于生物防治，肖倩等[31]經過離體葉片和盆栽試驗發現貝萊斯芽孢桿菌HMQAU19044對黃瓜霜霉病有抑制作用，對染病的黃瓜幼苗葉片有保護和治療作用；王青華等[32]研究表明，深海貝萊斯芽孢桿菌DH82對部分水產細菌性疾病有較好防治效果，也能有效抑制引起植物枯萎病的水賊鐮刀菌。

圖4 基于16S rDNA基因序列菌株NO.4.1.3-1的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain NO.4.1.3-1 based on 16S rDNA gene sequence

2.4 菌株NO.4.1.3-1的抑菌譜

菌株NO.4.1.3-1抑菌譜的測定結果見表3。由表3可知，該菌具有廣譜的抑菌性，對供試的革蘭氏陽性、陰性菌以及真菌致病菌都有一定的抑制作用。除了對屎腸球菌無抑制效果外，該菌對8株常見致病菌均有抑制作用。此外，在5株革蘭氏陰性致病菌中，菌株NO.4.1.3-1對肺炎克雷伯氏菌的拮抗效力最強，抑菌圈直徑達到（19.11±0.28）mm；在供試的革蘭氏陽性致病菌中，菌株NO.4.1.3-1對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，抑菌圈直徑達到（18.85±0.51）mm。WANG C等[33]研究發現，蘋果樹根際土壤來源的一株貝萊斯芽孢桿菌不僅具有拮抗擬輪枝鐮孢菌（Fusarium oxysporum）的能力，而且能夠促進湖北海棠的生長；任津瑩等[34]從農田土壤中篩選獲得1株有抑菌作用的貝萊斯芽孢桿菌N-3，該菌對金黃色葡萄球菌的抑制作用較強，與本試驗結果一致。

表3 菌株NO.4.1.3-1抑菌譜的測定結果Table 3 Determination results of antibacterial spectrum of strain NO.4.1.3-1

3 結論

本研究以丁香假單胞菌為指示菌，從印度洋沉積物中共分離出115株海洋微生物，其中33株對丁香假單胞菌有抑制作用，抑菌效果最優的為菌株NO.4.1.3-1，其抑菌圈直徑達（12.63±0.06）mm。通過形態學觀察、生理生化試驗及分子生物學技術鑒定其為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。除屎腸球菌外，菌株NO.4.1.3-1對8種致病菌均有抑制作用，且對肺炎克雷伯氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌作用較好，具有較廣的抑菌譜。