天麻酒滲漉工藝優化及其對小鼠肝組織的影響

李幼娟，李立郎，陳發菊，王 麗，葛麗娟，文 平，國光梅，楊小生*

（1.貴州醫科大學 藥學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550014；3.貴州九龍天麻有限公司，貴州 畢節 551600）

天麻（Gastrodia elataBl.）又名赤箭、獨搖芝等[1]，為蘭科（Orchiidaceae）植物天麻的塊莖部分，是重要的藥食同源植物之一，與靈芝、杜仲并稱為“貴州三寶”，含多種活性成分。2019年國家衛生健康委員會發布對天麻等9 種物質開展按照傳統既是食品又是中藥材的物質管理試點工作的通知[2]，以其為原料的保健品和藥膳的研究與開發逐漸受到關注，天麻酒作為天麻在食品領域的特色產品，具有較大的研究前景及開發價值。早期研究中天麻酒的提取周期過長，提取率不高。袁志鷹等[3]采用泡制的方法研究了天麻酒在不同泡制時間的藥效成分溶出規律；于倩等[4]采用固態白酒浸泡的方式通過單因素，正交試驗確定了提取天麻素的最佳條件并改善了天麻酒的口感。不少研究表明，滲漉法的動態提取的效率一般優于傳統浸泡法[5]。以滲漉法制取天麻酒的工藝研究還有待科學的研究及探索，這將為天麻酒的生產開發提供新思路以及為今后的研究提供理論參考。

本研究以醬香型白酒、天麻為主要原料配以西洋參、枸杞子通過滲漉工藝制備天麻酒。采用天麻素、對羥基苯甲醇、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的功能成分溶出率之和為評價指標，探討原料粒徑、浸泡時間、料液比對天麻酒最佳滲漉工藝的影響，在單因素試驗的基礎上進行響應面試驗，確定天麻酒的滲漉工藝，并采用小鼠模型分析天麻酒對小鼠肝組織的影響，探究滲漉工藝對天麻酒品質的影響以及其與普通酒對肝損傷的區別，為其在大健康產品開發方面提供理論基礎和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天麻：貴州畢節大方縣；西洋參：吉林長白山；枸杞子：寧夏中寧；53%vol醬香型白酒基酒基：貴州省仁懷市茅臺鎮；天麻素、對羥基苯甲醇、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1標準品（純度＞98.0%）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）、Bradford蛋白檢測試劑盒：索萊寶生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：美國TEDIA天地試劑公司；磷酸（分析純）：重慶川東化工集團有限公司；4%多聚甲醛溶液：北京雷根生物技術有限公司；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）試劑盒、白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）試劑盒：武漢華美生物工程有限公司；谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒：南京建成生物工程研究所。

雄性昆明（KM）小鼠50只，體質量（20±2）g，購于重慶騰鑫生物技術有限公司，動物生產許可證SCXK（京）2019-0008，飼養于溫度（22±2）℃、相對濕度（55±5）%的清潔級動物房，控制照明時間為每天12 h，自由飲水和進食。

1.2 儀器與設備

滲漉筒：鄭州科教玻璃儀器商城；Aniglent1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫科技有限公司；Phenomenex C18色譜柱：美國飛諾美科技有限公司；Scilogex MX-S漩渦混合器：美國Scilogex公司；有機系微孔濾膜（0.22 μm）：北京蘭杰柯科技有限公司；JA2003電子天平：上海菁海儀器有限公司；Millpore TM-D24UVB純水超純水一體機：美國Millipore公司；Eppendorf F5427R臺式高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；-80 ℃900 Series超低溫冰箱、Varioskan LUX酶標儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；IMS-50雪花制冰機：山東博科生物產業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 天麻酒的滲漉工藝流程及操作要點

原料預處理→稱取原料→倒入滲漉裝置→加酒基浸泡→收集滲漉液→定量→天麻酒

操作要點：

原料預處理：用純凈水將53%vol酒基稀釋成37%vol酒基；精選表面干凈、塊頭較大的天麻、西洋參、枸杞干果，切片、粉碎、過篩，備用。

稱取原料：將過篩后的天麻、西洋參、枸杞按50∶3∶15質量比混勻，精密稱取混合好的原料3.4 g。

酒基的浸泡：加入干物料9倍質量的37%vol酒基室溫（25±2）℃浸泡6 h。

定量：收集滲漉液后，加入37%vol酒基定容至50 mL，得到天麻酒成品。

1.3.2 天麻酒滲漉工藝優化

（1）單因素試驗

以天麻素、對羥基苯甲醇、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的溶出率之和為評價指標，分別探討原料粒徑（10目、24目、50目、65目、80目）、浸泡時間（2 h、4 h、6 h、8 h、10 h）、料液比（1∶3、1∶5、1∶7、1∶9、1∶11（g∶mL））對功能成分溶出率的影響。

（2）響應面試驗

在單因素試驗基礎上，采用響應面試驗設計，以粒徑（A）、浸泡時間（B）、料液比（C）為自變量，天麻素、對羥基苯甲醇、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的功能成分溶出率之和（Y）為響應值，應用Design-Expert 8.0.6軟件設計3因素3水平的響應面試驗以確定最優的滲漉方法，Box-Behnken試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.3 功能成分含量的檢測

采用高效液相色譜法測定天麻酒中天麻素、對羥基苯甲醇、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量，測定方法參考2020版中國藥典[5]略作修改。

樣品處理：將天麻酒過0.22 μm一次性針頭式過濾器于樣品瓶中，濾液待測。

高效液相色譜條件：Phenomenex C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測波長為203 nm；柱溫40 ℃；流動相：0.05%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）；洗脫條件：0～16 min，98%A；16～25 min，98%～75%A；25～40 min，75%～65%A；流速：0.6 mL/min。

天麻素、對羥基苯甲醇、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1四種功能成分溶出率計算公式如下：

1.3.4 天麻酒對小鼠肝組織的影響

（1）天麻酒低、中、高劑量的制備與小鼠分組

不同產地梅花鹿鹿茸藥材中5種核苷類成分的含量測定及聚類分析 ……………………………………… 劉雪瑩等（14）：1945

根據《中國居民膳食指南2016》中國成年男性每日推薦量不超過25 g純酒精（相當于37%vol白酒85 mL），成年女性每日飲酒不超過15 g（相當于37%vol白酒50 mL），選擇成人每日推薦量60 mL/（70 kg體質量·d），根據人鼠劑量換算，確定天麻酒的灌胃劑量為10 mL/kg。用同種37%vol酒基按最佳工藝制成的天麻酒作為中劑量，同等工藝減半藥材量配制為低劑量，兩倍的藥材量配制作為高劑量。取50只KM小鼠，隨機分為空白組，模型組（37%vol相同酒基），天麻酒低、中、高劑量組。所有小鼠按10 mL/kg進行灌胃，其中空白組灌胃生理鹽水，模型組灌胃等量天麻酒的酒基，低、中、高劑量組灌胃天麻酒，每天1次，連續灌胃21 d。

（2）肝組織中生化指標的檢測[7]

于末次灌胃結束后，小鼠禁食24 h，處死小鼠并摘取肝臟。準確稱量0.1 g肝組織剪碎后加入0.9 mL的PBS，置于冰上研磨制備肝勻漿，在5 000 r/min下離心10 min，取上清液參照試劑盒要求測定小鼠肝組織中的ALT、AST、SOD活力、MDA、IL-4、IL-6、TNF-α、PGE2含量。

1.3.5 數據處理

采用Graphpad Prism 8.01繪圖，Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗設計，數據分析采用SPSS 21.0軟件進行分析，結果以“平均數±標準差”（xˉ±s）表示，組間均數比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示具有顯著性差異，P＜0.01表示具有極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 原料粒徑對天麻酒中功能成分溶出率的影響

粒徑對于滲漉是一個重要的影響因素[8]。原料粒徑對天麻酒中功能成分溶出率之和的影響結果見圖1。由圖1可知，粒徑在10～50目范圍內，隨著粒徑目數的增大，四種功能成分的溶出率之和呈逐步上升趨勢；當粒徑目數到達50目時，四種功能成分的溶出率之和為3.519 mg/g；當粒徑目數＞50目之后，藥材的粒徑對功效成分的溶出率變化影響不再顯著。由于藥材顆粒過大，會導致溶劑消耗量過大，且溶出不充分。但當粒徑過細時，會使藥材粉末易結塊，從而增加傳質阻力使傳質速率降低，不利于有效成分的溶出[9]，由于藥渣吸附酒也可能導致溶出率減小，且易造成滲漉過程中堵塞，增加試驗的操作難度。因此，選擇原料粒徑為40目、50目、60目進行后續試驗。

圖1 原料粒徑對功能成分溶出率的影響Fig.1 Effect of raw material particle size on the dissolution rates of functional components

2.2 浸泡時間對天麻酒中功能成分溶出率的影響

滲漉法在滲漉前浸泡一定時間，更有利于各成分的溶質交換[10]。一般情況下浸漬時間較長時，活性成分浸出較多，但浸漬時間足夠長時，藥材中活性成分含量與溶液中含量會達到動態平衡，繼續浸漬意義不大。隨著時間延長，天麻素等物質可能由于分解或其他原因含量略微下降[3]。浸泡時間對天麻酒中功能成分溶出率之和的影響結果見圖2。由圖2可知，當滲漉前浸泡時間為2～6 h時，四種功能成分的溶出率之和呈逐步上升趨勢，更有利于滲漉效率；當浸泡時間為6 h時，四種功能成分的溶出率之和最高，為3.474mg/g；當浸泡時間＞6h之后，功效成分的溶出率之和變化不再顯著。因此，選擇浸泡時間5 h、6 h、7 h進行后續試驗。

圖2 浸泡時間對功能成分溶出率的影響Fig.2 Effect of soaking time on the dissolution rates of functional components

2.3 料液比對功能成分溶出率之和的影響

料液比對天麻酒中功能成分溶出率之和的影響結果見圖3。由圖3可知，當料液比為1∶3～1∶9（g∶mL）時，四種成分溶出率之和隨之呈升高趨勢；當料液比為1∶9（g∶mL）時，四種功能成分的溶出率之和最高，為3.547 mg/g；當料液比為1∶9～1∶11（g∶mL）時，各物質溶出率之和隨滲漉液增加變化不顯著，可能是由于高料液比時所測成分充分溶解，但其他類雜質溶解增多，使得相對溶出率下降[11]。當料液比較小時，部分物質可能在滲漉過程中很快達到飽和狀態，不能全部溶出，從而導致溶出率較低[12]。因此，選擇料液比1∶7、1∶9、1∶11（g∶mL）進行后續試驗。

圖3 料液比對功能成分溶出率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the dissolution rates of functional components

2.4 響應面試驗結果分析

2.4.1 回歸模型的建立及方差分析

在單因素試驗基礎上，采用響應面試驗設計，以粒徑（A）、滲漉前浸泡時間（B）、料液比（C）為自變量，天麻素、對羥基苯甲醇、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的功能成分溶出率之和（Y）為響應值進行響應面試驗，Box-Behnken試驗設計及結果見表2。采用Design Expert 8.0.6軟件對表2中試驗結果進行多項回歸擬合，得到天麻素、對羥基苯甲醇、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的溶出率之和（Y）對粒徑（A）、浸泡時間（B）、料液比（C）的二次多項回歸模型方程如下：

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

為檢驗回歸方程有效性并確定各因素對功能成分溶出率之和的影響程度，對回歸模型進行方差分析，結果見表3。由表3可知，所建立方程模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），表明該模型方程與實際擬合度較好[13]。決定系數R2=0.987 8，調整決定系數R2Adj=0.972 1。根據P值可知，一次項A、B、C對功能成分溶出率之和存在顯著影響（P＜0.05）；二次項A2、B2、C2均對功能成分溶出率之和的曲面效應影響極顯著（P＜0.01）。根據F值可知，各因素的影響順序為粒徑（A）＞浸泡時間（B）＞料液比（C）。

表3 回歸方程系數顯著性檢驗和方差分析Table 3 Significance test and variance analysis of regression equation coefficient

2.4.2 影響因子交互作用分析及驗證試驗

影響因子交互作用響應面圖中，曲面越陡峭，則該因素對響應值的影響越顯著，曲面越平，則該因素對響應值的影響越小[14-15]。由圖4可知，浸泡時間和原料粒徑、浸泡時間和料液比、原料粒徑和料液比間的交互作用均不顯著，試驗結果與方差分析結果一致。

圖4 各因素間交互作用對功能成分溶出率影響的響應曲面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on dissolution rates of functional components

通過軟件Design-Expert8.0.6分析得到天麻酒最佳滲漉條件：原料粒徑51.33目，浸泡時間6.13h，料液比1∶9.27（g∶mL），在此條件下，功能成分溶出率之和理論值為3.615 mg/g。考慮到實際操作的簡便，將滲漉條件調整為：粒徑50目，料液比1∶9（g∶mL），浸泡時間6 h。在此優化條件下，經3次平行試驗驗證，功能成分溶出率之和實際值為（3.592±0.011）mg/g，結果與理論值相差不大，由此表明該試驗模型可靠。

2.5 天麻酒對小鼠肝組織的影響

2.5.1 天麻酒對小鼠肝組織轉氨酶水平的影響

谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）主要存在于肝細胞漿和線粒體內，是催化氨基酸和酮酸之間氨基轉移的酶[16]，當肝細胞受到損傷時，酶的活性會升高。常用ALT和AST的水平評價肝功能的損傷程度[17]。如表4所示，與空白組相比，模型組小鼠肝組織中ALT和AST水平顯著升高（P＜0.05），說明在酒精的長期刺激作用下，ALT、AST分泌持續增多，肝細胞受損程度大于自我修復能力，形成肝損傷。天麻酒各劑量組與模型組相比肝組織中ALT和AST水平都顯著低于模型組（P＜0.05），與飲用等量酒基相比，天麻酒能有效抑制轉氨酶水平，使其趨于正常，說明天麻酒中的活性成分減輕了酒精對肝臟的損傷作用。

表4 天麻酒對小鼠肝組織谷丙轉氨酶及谷草轉氨酶水平的影響Table 4 Effects of Gastrodia elata wine on alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase levels in mice liver tissue

2.5.2 天麻酒對小鼠肝組織抗氧化酶活性影響

長期飲酒會促進自由基如活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的生成積累，打破肝組織抗氧化體系的平衡，引起氧化應激[18]。過量的ROS誘導產生脂質過氧化產物MDA，同時消耗SOD清除自由基來維持內環境穩態[19]。因此SOD、MDA的活性可反映自由基對肝臟的損傷程度[20]。

如表5所示，與空白組相比，飲酒后各組小鼠肝組織中SOD活性下降，MDA活性升高，其中模型組差異性顯著（P＜0.05），說明長期飲酒導致肝臟脂質過氧化加重，抗氧化水平減弱[21]，提示酒精性肝損傷模型建立成功。天麻酒各劑量組與模型組相比，小鼠肝組織中SOD活性顯著升高，MDA活性顯著降低（P＜0.05）。說明飲酒會導致機體發生脂質過氧化，而天麻酒中的活性成分可能通過減輕小鼠體內的氧化應激程度，緩解由于酒精攝入導致的肝損傷。

表5 天麻酒對小鼠肝組織超氧化物歧化酶及丙二醛水平的影響Table 5 Effects of Gastrodia elata wine on superoxide dismutase and malondialdehyde levels in mice liver tissue

2.5.3 天麻酒對小鼠肝組織中炎癥因子的影響

酒精及其代謝產物乙醛可誘導促炎細胞因子的釋放，從而加重肝臟炎癥和肝細胞凋亡[22]。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）會促進中性粒細胞、單核細胞遷移并激活，加速活性氧自由基的生成，導致肝臟的進一步損害[23]；白細胞介素-6（IL-6）在導致炎癥反應的組織損傷過程中可直接誘導免疫細胞分化，損傷細胞[24]；白細胞介素-4（IL-4）可促進免疫應答，與傷口修復和肝臟再生有關[25]；前列腺素E2（PGE2）是一種重要的致炎因子，可以使血管通透性增加，使炎性細胞更易浸潤。

如表6所示，模型組小鼠肝組織中IL-4、IL-6、TNF-α、PGE2水平顯著高于空白組（P＜0.05），說明酒精攝入導致肝細胞釋放大量促炎因子，模型建立成功[26]。天麻酒中、高劑量組與模型組相比，IL-4、IL-6、TNF-α、PGE2水平顯著低于模型組（P＜0.05）。說明天麻酒中的活性成分可能通過抑制促炎細胞因子、緩解炎癥反應對小鼠肝組織起保護作用。

表6 天麻酒對小鼠肝組織白細胞介素-4、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α及前列腺素E2水平的影響Table 6 Effects of Gastrodia elata wine on interleukin-4、interleukin-6、tumor necrosis factor-α and prostaglandin E2 levels in mice liver tissue

3 結論

通過單因素和響應面試驗分析結合驗證試驗得到制備天麻酒的最佳工藝條件為：原料粒徑50目、料液比1∶9（g∶mL）、浸泡時間6 h。在此優化條件下，4種功能成分溶出率之和為3.592 mg/g。該工藝制備方法操作簡單，所研制的天麻酒色澤澄清透亮、活性成分豐富，具有較好的推廣價值。天麻酒能有效降低小鼠肝組織的AST、ALT生化指標，肝細胞炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-4、PGE2）水平以及提高抗氧化酶SOD，降低MDA水平，說明天麻酒具有減緩因酒精攝入導致的肝損傷作用。這為貴州天麻資源利用及特色食品產業的發展提供新思路。