不同品種葡萄表皮真菌菌群的多樣性分析

于其可，王 賽，王 盼，陳偉康，劉璐寬，姚淑敏

（曲阜師范大學 生命科學學院，山東 濟寧 273100）

葡萄酒是一種常見的酒精飲品，在葡萄酒自然發酵過程中，葡萄酒的風味及品質除了受到品種的影響以外，微生物對葡萄酒的特征也具有較大影響[1-2]。葡萄果實的表面聚集著大量不同種群的微生物，微生物種類、數量及所占比例均不相同。

VARANDA C M R等[3]在不同管理模式下探究了幾種不同品種的葡萄的真菌內生群落的差異，表明葡萄生產的不同產物對內生真菌的組成有影響。NEMCOVA K等[4]研究發現葡萄中的酵母的多樣性和分布取決于許多因素，如葡萄的品種、葡萄的物理破壞、天氣條件和葡萄汁的化學成分等。BRYSCH-HERZBERG M等[5]通過26S rDNA D1/D2序列來分析德國釀酒葡萄的酵母多樣性，結果表明葡萄汁中分離出的酵母菌株主要屬于有孢漢遜酵母和梅氏酵母，還發現兩個潛在的新物種近粉紅鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）和花形絲狀桿菌（Filobasidium floriforme）。BOKULICH N A等[6]通過高通量測序方法研究了美國加利福尼亞地區‘霞多麗’、‘赤霞珠’、‘仙粉黛’釀酒葡萄汁中的微生物群落，發現其中枝孢霉菌、假單胞菌、青霉菌是主要的真菌類群。

目前我國對不同品種葡萄表皮微生物群落的研究相對較少。趙昱等[7]研究了不同產區的‘赤霞珠’葡萄果皮上微生物的多樣性，發現在門水平4個產區的優勢真菌門為子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota），而不同產區釀酒葡萄上的優勢微生物在屬水平存在較大的差異。王慧等[8]利用26S rDNA D1/D2序列分析，并結合形態及生理學特征，探討中國主要釀酒葡萄產區葡萄果粒上酵母菌物種的多樣性及其分布，結果表明，在新疆、甘肅、陜西、寧夏、山東五個地域酵母菌種構成基本相似。其中優勢屬為漢遜酵母屬（Hanseniaspora）（5種）、假絲酵母屬（Candida）（4種）、畢赤酵母屬（Pichia）（4種）和伊薩酵母屬（Issatchenkia）（2種）。張世偉等[9]應用高通量測序技術，分析沙城地區不同品種釀酒葡萄表皮的微生物群落，表明葡萄品種是影響微生物群落的最重要的因素。

高通量測序技術又稱下一代測序（next-generationse quencing，NGS）技術，是目前應用最普遍的測序技術，克服了傳統培養技術及分子鑒定方法的缺陷，可以快速對微生物多樣性進行分析，對微生物的群落結構分析具有獨特的優勢[11]。本實驗基于葡萄表皮的真菌展開研究，真菌中影響葡萄酒發酵釀造的主要是酵母菌，酵母菌包括釀酒酵母和非釀酒酵母。酵母菌群微生物的特點及結構，是成功釀造優質酒水，充分發揮不同區域不同品類葡萄特質的關鍵因素。非釀酒酵母作為葡萄酒非接種發酵釀造中的主要菌群，是造成葡萄酒品質下降的原因之一，但其所發揮的代謝作用可能對酒的口感味道有著重要的影響[10]。‘黑提’、‘玫瑰香’、‘陽光玫瑰’、‘紅提’在本地種植相對豐富，是主要的食用品種，本實驗對常見葡萄的表皮微生物進行比較分析，探究不同品種葡萄表皮上真菌的多樣性，明確優勢物種，對于葡萄酒品質的提高，挑選優質原料和特色發酵菌株具有理論指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隨機選取山東省濟寧市曲阜市石門山的‘黑提’、‘玫瑰香’、‘陽光玫瑰’、‘紅提’各20株生長良好的葡萄植株，采集同一植株上、中、下三個部位的成熟果實，置于無菌袋中，并混合均勻。

DNeasy PowerSoil試劑盒、QIAamp 96 PowerFecal QIAcube HT試劑盒：美國QIAGEN公司；Qubitds脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Assay試劑盒：美國Life Technologies公司；Tks Gflex DNA聚合酶（1.25 U/μL）：大連Takara公司。

PBS緩沖液（pH=7.4）：在800 mL蒸餾水中溶解8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4，用HCl溶液調節溶液的pH值至7.4，加水定容至1 L，在121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。保存于室溫，待用[7]。

1.2 儀器與設備

Centrifuge 5418型臺式高速離心機：德國Eppendorf公司；580BR10905型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國Bio-rad公司；SN 002358型QIAxtractor高通量核酸提取儀：美國QIAGEN公司；HE-120型電泳儀、2500凝膠成像儀：上海Tanon公司；2100 Bioanalyzer生物分析機：美國Aglient公司；NanoDrop 2000微量分光光度計：美國Thermo Fisher公司；XH-D漩渦混合器：深圳沃信科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

用75%酒精消毒后的剪刀采集新鮮的葡萄（‘黑提’、‘玫瑰香’、‘陽光玫瑰’、‘紅提’）果實，放置于無菌自封袋中，低溫保存并帶回實驗室，-20 ℃保存備用。

1.3.2 DNA提取、PCR擴增

稱50 g葡萄果實，加入200 mL PBS緩沖液（0.1 mol/L，pH7.0），200 r/min渦旋振蕩30 min，超聲15 min，0.22 μm微孔濾膜過濾，用無菌剪刀剪碎濾膜并放入無菌離心管中[12]。采用DNeasyPowerSoilKitDNA抽提試劑盒對樣本的基因組DNA進行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000檢測DNA的濃度。

采用真菌ITS 區引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）[13]，使用Tks Gflex DNA聚合酶進行PCR擴增。PCR產物使用電泳檢測，檢測后使用磁珠純化，純化后作為二輪PCR模板，并進行二輪PCR擴增，并再次使用電泳檢測，檢測后使用磁珠純化，純化后對PCR產物進行Qubit定量。根據PCR產物濃度進行等量混樣，并上機測序。

取5 μL純化過的二輪產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測是否有條帶和條帶是否單一。取1 μL純化過的二輪產物使用Qubit進行濃度檢測。根據PCR產物濃度進行等量混樣，并上機測序。高通量測序過程由上海歐易生物醫學科技有限公司完成。

1.3.3 高通量測序

使用Trimmomatic（version 0.35）[14]軟件采用滑動窗口法對原始測序序列進行質控，使用Flash（version 1.2.11）[15]軟件進行拼接。使用QIIME中的split libraries（version 1.8.0）[16]軟件去除paired end序列中含有N堿基的序列，去除單堿基重復＞8的序列，去除長度＜200 bp的序列，得到clean tags序列。使用UCHIME（version 2.4.2）[17]軟件去除clean tags中的嵌合體，最終得到用于OTU劃分的valid tags。

1.3.4 數據處理與統計學分析

采用Vsearch[16]軟件進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，對質控得到的優質序列valid tags按照97%的相似度進行OTU分類，并選取每個OTU中豐度最大的序列作為該OTU的代表序列。采用RDP classifier Naive Bayesian分類算法[18]將OTU代表序列與Unite數據庫進行比對，注釋使用blast[19]軟件。使用QIIME軟件計算Chao1、Shannon、Simpson和樣本覆蓋率Alpha多樣性指數的計算。通過基于Bray Curtis距離矩陣算法的主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA），進行Beta多樣性分析。通過ANOVA統計算法，計算不同分組間的差異物種，并進行差異物種熱圖等的繪制。最后，通過計算物種間的相關性（Spearman系數等），將獲得的數值矩陣直觀的展示到相關性heatmap圖中，將豐度前30的屬，使用R軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 OTU分析

Venn圖用于統計多個樣本中所共有和獨有的OTU數目，可直觀地表現樣本的OTU數目組成相關性及重疊情況[20]，將每個品種的三個平行組擁有的菌種合并，葡萄皮中真菌OTUs Venn圖見圖1。由圖1可知，‘紅提’的OTU數為2 910個，‘陽光玫瑰’的OTU數為2 597個，‘玫瑰香’的OTU數為3 028個，‘黑提’的OTU數為1 525個，從四個品種的葡萄檢測出的真菌共有OTU數為1 004個，‘紅提’特有的OTU數為448個，占其總數的15.40%；‘陽光玫瑰’特有的OTU數為359個，占其總數的13.82%；‘玫瑰香’特有的OTU數為562個，占其總數的18.56%；‘黑提’特有的OTU數為155個，占其總數的10.16%。

圖1 葡萄表皮中真菌OTUs Venn圖Fig.1 OTUs Venn of fungi on grape surface

2.2 不同品種葡萄表皮上真菌菌群的Alpha多樣性分析

α-多樣性是評價微生物群落豐富性和多樣性的指標[21]。計算豐富度指數Chao1，反映樣品的豐富度，數值越高說明群落物種的豐富度越高。計算多樣性指數Shannon，反映樣品的多樣性程度，Shannon和Simpson數值越高說明群落物種的多樣性越高[9]。不同品種的葡萄表皮上真菌菌群α樣品多樣性指數見表1。

由表1可知，不同品種的葡萄表皮所有樣本覆蓋率均在0.99以上，表明樣本的測序結果能真實反映樣本條件。不同品種葡萄表皮上真菌菌群多樣性指數分析顯示，Chao1指數最大的為‘紅提’，最小的為‘陽光玫瑰’，說明這4種葡萄表皮‘紅提’真菌群落最豐富，‘陽光玫瑰’則最稀少。真菌菌群的α多樣性指數Shannon最大的為‘紅提’，‘黑提’和‘玫瑰香’較小，Simpson與之基本相同，說明這4種葡萄表面‘紅提’真菌群落多樣性最高，‘玫瑰香’和‘黑提’較低。

表1 不同品種的葡萄表皮真菌菌群樣品α多樣性指數Table 1 Alpha diversity indexes of fungal community diversity from grape surface of different varieties

豐度等級曲線用于同時解釋樣品多樣性的兩個方面：物種的豐富程度由曲線在橫軸上的長度來反映，橫軸的跨度越大，表示物種的組成越豐富；物種組成的均勻程度由曲線的形狀來反映，曲線越平坦（縱軸的跨度越小），表示物種組成的均勻程度越高，4種葡萄表皮菌落的豐度等級曲線見圖2。由圖2可知，‘紅提’的物種豐富程度最大，物種組成的均勻程度也最高。隨著測序深度的增加，每個樣品的稀釋曲線均趨于平緩，表明測序深度足夠大，可以充分反應樣品中真菌菌群的多樣性情況。

圖2 4種葡萄表皮真菌的豐度等級曲線Fig.2 Rank abundance curves of fungi in grape surface of four grape varieties

2.3 不同品種葡萄表皮上的真菌群落組成及其相關性

2.3.1 真菌群落組成

在樣品中共檢測并鑒定到種的真菌有1 085種，隸屬于13門、37綱、109目、238科、532屬，其中部分菌只能鑒定到屬未能鑒定到種。不同品種葡萄表皮微生物在門和屬水平上的比較結果見圖3。

由圖3A可知，不同品種的葡萄表皮在真菌門水平的優勢菌群主要為子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）。在這三個門中，占比最高的是子囊菌門，在‘黑提’總真菌中占比最高為87.05%，在‘陽光玫瑰’總真菌中占比最低也達到68.36%。

由圖3B可知，不同品種的葡萄表皮真菌菌群主要分布在6個屬：威克漢姆酵母（Wickerhamomyces）、鐮刀菌屬（Fusarium）、畢赤酵母屬（Pichia）、小畫線殼屬（Monographella）、念珠菌屬（Candida）、古根菌屬（Archaeorhizomyces）。

圖3 不同品種葡萄表皮真菌在門（A）和屬（B）水平上的比較Fig.3 Comparison of fungi on grape surface with different grape varieties at phylum (A) and genus (B) level

2.3.2 真菌群落組成的相關性

排名前10的差異物種豐度結果見圖4。由圖4可知，‘黑提’中的威克漢姆酵母菌屬（Wickerhamomyces）和畢赤酵母屬（Pichia）的相對豐度遠高于其他品種，鐮刀菌屬（Fusarium）、小畫線殼屬（Monographella）、念珠菌屬（Candida）、古根菌屬（Archaeorhizomyces）在四種品種的葡萄表皮中豐度無顯著性差異（P＞0.05）。

圖4 排名前10的差異物種豐度箱型圖Fig.4 Boxplot of the abundance of the top 10 differential genus species

排名前30的差異物種相關性結果見圖5。由圖5可知，真菌菌群的不同屬之間存在顯著的相關性。威克漢姆酵母（Wickerhamomyces）與畢赤酵母屬（Pichia）呈明顯的正相關，它們都與鐮刀菌屬（Fusarium）呈現負相關。而小畫線殼屬（Monographella）、古根菌屬（Archaeorhizomyces）和鐮刀菌屬（Fusarium）這三種屬之間呈現明顯的正相關。

圖5 排名前30的差異物種相關性熱圖Fig.5 Heatmap of the top 30 differential species correlations

2.4 不同品種葡萄表皮上真菌的Beta多樣性分析

真菌群落主坐標分析及UPGMA聚類分析結果見圖6。由圖6A可知，對四種葡萄表皮上細菌群落進行分析繪制PCoA分析圖，當PC1為62.49%，PC2為34.51%時，四種葡萄在真菌菌落上存在一定的差異和相似性，‘陽光玫瑰’和‘紅提’的真菌群落相似性較高，‘玫瑰香’與‘陽光玫瑰’‘紅提’的相似性較低，‘黑提’與這三種葡萄距離較遠，相似性更低。

圖6 真菌群落主坐標分析（A）及UPGMA聚類分析（B）結果Fig.6 Principal coordinate analysis (A) and UPGMA clustering (B)analysis results of fungal community

由圖6B可知，將所有樣品的真菌群落進行聚類分析，結果顯示與主坐標分析結果基本一致。‘黑提’的樣品首先與其他品種產生分支，然后‘玫瑰香’的所有樣品與‘陽光玫瑰’、‘紅提’產生分支，而‘陽光玫瑰’和‘紅提’的樣品交互在一起，無明顯差異。

2.5 中心OTU及最相似序列分析

將所有樣本中均出現的OTU定義為中心OTU，得到28個相對豐度較高的真菌OTU，將這些OTU的代表序列在美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）上進行Blast序列比對，結果見表2。由表2可知，不同品種葡萄表面真菌主要有鐮刀菌（Fusariumsp.）（OTU254、OTU2028、OTU4312）、糞殼菌（Sordarialessp.）（OTU241）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）（OTU46）、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomycesanomalus）（OTU115）、出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）（OTU157）、南極低溫酵母（Guehomyces pullulans）（OTU175）等。

表2 不同品種葡萄表皮真菌中心OTU及對應相似序列Table 2 Central OTU of fungus of grape surface of different varieties and its corresponding similar sequences

續表

2.6 討論

葡萄酒的特征性風味不僅來自葡萄品種和釀酒手法，酵母菌對葡萄酒的釀造也有很大的影響，決定了葡萄酒的風味及品質。在葡萄酒釀造過程中酵母菌分為釀酒酵母和非釀酒酵母，威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）、畢赤酵母屬（Pichia）和念珠菌屬（Candida）都屬于非釀酒酵母。早期非釀酒酵母是從變質的葡萄酒中分離出來的，因其產生高水平的揮發性酸和一些負化合物且對二氧化硫和酒精敏感，因此最初會導致葡萄酒的腐敗。但是近年來研究發現，非釀酒酵母的參與使得葡萄酒有著良好的風味和品質。畢赤酵母屬（Pichia）和念珠菌屬（Candida）具有不同程度的β-葡萄糖苷酶活性，可幫助葡萄中的風味和香氣化合物等的非揮發性前體分解，釋放揮發性化合物，從而改善葡萄酒的風味品質[22]。

根據真菌中心OTU，得到葡萄表面的一些主要菌種。真菌中心OTU結果顯示釀酒葡萄表面含有鐮刀菌（Fusariumsp），研究表明其可產生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），對動物和人類健康有著潛在的危害，DON具有多方面的毒性作用，而厭食和嘔吐是機體攝入DON后出現的最典型癥狀，厭食和嘔吐的產生主要歸因于DON對中樞神經系統和胃腸道食欲因子的影響[23]。糞殼菌屬（Sordarialessp.）通常為葡萄根部的內生菌，而尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）也是葡萄內生真菌的優勢菌群[24]。出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）是一類酵母真菌[25]，是葡萄表皮菌群中最主要的溶解果膠的物種（果膠分解菌株），在酒色的發展和穩定性方面具有重要的作用[26]。異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）具有很強的產酯能力，能夠提高酒的含酯量，對于酒香的產生具有重要作用[27]。

本研究有助于對不同品種葡萄表皮真菌多樣性的認知，后續可在此基礎上進一步分析含有真菌的具體代謝途徑和生理生化反應來探究其對發酵葡萄酒的風味和品質的影響，可為篩選發酵葡萄酒優良釀酒酵母和非釀酒酵母提供指導意義。

3 結論

本研究以常見食用品種葡萄為研究對象，通過高通量測序技術探究了不同品種葡萄表皮真菌的多樣性。不同品種釀酒葡萄表皮微生物群落結構具有一定的差異，‘紅提’表皮真菌的多樣性和豐度均高于其他品種。本實驗研究的幾種釀酒葡萄表面真菌在門水平上的優勢菌群主要為：子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）。在屬水平上的優勢菌群主要為：威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）、鐮刀菌屬（Fusarium）、畢赤酵母屬（Pichia）、小畫線殼屬（Monographella）、念珠菌屬（Candida）、古根菌屬（Archaeorhizomyces）。不同品種的葡萄表面的真菌優勢菌群在門水平差異相對較小，3個優勢門的真菌占‘黑提’總真菌數最高，為93.53%，在‘紅提’中占比最低，為84.67%。但在屬水平差異較大，其中‘黑提’中的威克漢姆酵母菌屬（Wickerhamomyces）和畢赤酵母屬（Pichia）的相對豐度遠高于其他品種，鐮刀菌屬（Fusarium）、小畫線殼屬（Monographella）、念珠菌屬（Candida）、古根菌屬（Archaeorhizomyces）在四種品種的葡萄表皮中豐度無顯著性差異。真菌菌群的不同屬之間存在顯著的相關性，威克漢姆酵母（Wickerhamomyces）與畢赤酵母屬（Pichia）呈明顯的正相關，它們都與鐮刀菌屬（Fusarium）呈現負相關。而小畫線殼屬（Monographella）、古根菌屬（Archaeorhizomyces）和鐮刀菌屬（Fusarium）這三種屬之間呈現明顯的正相關。