來鳳地區泡鳳頭姜鹽水細菌群落結構及功能解析

黃 怡，向秀連，王玉榮，張 彥，張海波，，郭 壯*

（1.湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽 441053；2.湖北文理學院 乳酸菌生物技術與工程襄陽市重點實驗室，湖北 襄陽 441053；3.安琪紐特股份有限公司 酵母功能湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443003）

鳳頭姜是湖北省恩施土家族苗族自治州來鳳縣的一種特色農作物，來鳳鳳頭姜亦是我國國家地理標志產品之一，其因外形形似古代神話中鳳凰的頭而得名[1]。鳳頭姜具有品質優良、風味獨特、富含硒元素和營養豐富等優點，是姜中獨具特色的佳品[2]。鳳頭姜的加工制品包括脫水姜片、紅生姜、姜油、姜汁和泡姜等[3]，其中泡姜是將鳳頭姜去皮切碎后與紅辣椒、大蒜、花椒、白酒和鹽等佐料混合后入壇密封發酵而成，具有質地脆嫩和口感酸鮮的特點[3]。

泡鳳頭姜發酵過程中微生物對產品的營養價值和安全性有著不可忽視的影響，因而對泡姜中微生物群系進行全面解析具有極為必要的意義。作為不依賴于純培養技術的技術方法，克隆文庫、磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）和變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技術在傳統發酵食品微生物群落結構研究中有著廣泛的應用[4]，但具有通量低和無法實現大樣本間群落結構平行分析的缺點[5]。近年來興起的以MiSeq高通量測序為代表的第二代測序技術[6]，具有測序結果可信度高，且能夠全面和客觀分析樣本中微生物群落結構的特點[7]，在發酵食品微生物多樣性研究[8]和植物內生菌多樣性解析[9]方面有著廣泛地應用。因而，將MiSeq高通量測序技術運用于來鳳泡鳳頭姜鹽水細菌多樣性的研究中具有一定的可行性。

本研究采用MiSeq高通量測序技術對湖北恩施土家族苗族自治州來鳳地區泡鳳頭姜鹽水中的細菌多樣性進行解析，在明確其細菌構成的基礎上，進一步對核心菌群進行甄別，并采用PICRUSt（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states）軟件對細菌類群的基因功能進行預測，以期為掌握來鳳地區泡鳳頭姜鹽水中細菌類群及多樣性提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

6份泡鳳頭姜鹽水樣品（編號為PJ1、PJ2、PJ3、PJ4、PJ5和PJ6）：采集自湖北省恩施州來鳳縣城南農貿大市場（E109°18′～109°27′，N29°25′～29°36′），均為當地農戶家中自制。其制作方法為在干燥清潔的土（陶）壇中放入洗凈的鳳頭姜，加入當地的辣椒、料酒、食鹽和花椒等輔料，加入適量陳泡菜水后混勻，蓋上壇蓋并用清水封住壇口以隔絕空氣，將土（陶）壇放在18～20 ℃的條件下自然發酵30 d即可。采集的樣品發酵時間均在30～40 d之間。

1.1.2 試劑

QIAGENDNeasymericonFoodKit：德國QIAGEN公司；10×聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶：北京全式金生物技術有限公司；正反向引物338F/806R：武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設備

Veriti FAST梯度PCR儀：美國ABI公司；164-5050基礎電源電泳儀：美國BIO-RAD公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統：美國Protein Simple公司；MiSeq PE300高通量測序平臺/PE300高通量測序平臺：美國Illumina公司；R920機架式服務器：美國DELL公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Nano Drop公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 泡鳳頭姜鹽水樣品DNA的提取

根據DNA提取試劑盒說明書提取泡鳳頭姜鹽水樣品的宏基因組DNA，并使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop對DNA質量及濃度進行檢測，以期獲得高質量和高濃度的DNA片段。

1.3.2 細菌16S rRNA V3～V4區PCR擴增及測序

以提取的基因組DNA為模板，采用正向引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和反向引物806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對泡鳳頭姜鹽水中微生物的16S rRNA V3～V4區基因序列進行PCR擴增[10-11]，將PCR擴增合格的產物清潔后委托上海美吉生物醫藥科技有限公司，使用MiSeq高通量測序平臺進行測序。

1.3.3 生物信息學分析

將測序結果進行質控[12]，使用QIIME（v1.70）平臺完成生物信息學處理[13]。具體方法如下：構建操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）[14]、去除嵌合體[15]、使用核糖體數據庫項目（ribosomal database project，RDP）（ribosomal database project，RDP）11.5數據庫進行同源性比對確定微生物學分類地位[16]，同時使用PICRUSt軟件對泡鳳頭姜鹽水中細菌微生物的基因功能進行預測[17]，并使用熱圖對結果進行可視化。

1.3.4 數據處理

采用Origin 8.5（OriginLab Corp，MA，USA）繪制序列分布長度、細菌門和屬相對含量以及OTU出現次數柱狀圖；采用皮爾森相關性分析對核心優勢OTU的相關性進行計算，根據其相關系數的大小使用R語言軟件（v4.1.0）繪制熱圖；使用R語言軟件（v4.1.0）繪制瀑布圖。

2 結果與分析

2.1 測序序列長度分布

納入本研究的6份泡鳳頭姜鹽水樣品共產生123 508條序列，經質量控制后得到123 471條有效序列，去除引物序列和barcode標簽序列后所有樣品的有效序列的堿基長度的分布情況見圖1。

圖1 泡鳳頭姜鹽水樣品中細菌菌群有效序列的堿基長度分布情況Fig.1 Distribution of base length of effective sequences of bacterial community in fermented Fengtou ginger brine samples

由圖1可知，泡鳳頭姜鹽水樣品中細菌菌群有效序列的堿基長度主要集中分布在444～452 bp，序列數占總序列數的93.10%，有6.53%的基因序列堿基長度集中在425～433 bp，另外僅有0.37%的基因序列堿基長度集中在0～433 bp。有研究表明，細菌16S rRNA的V3～V4區基因序列的堿基長度為338～806 bp[18]，結果表明，本研究測序所得到的序列基本可以覆蓋16S rRNA的V3～V4區，可用于后續研究。

2.2 泡鳳頭姜鹽水的細菌菌群結構分析

2.2.1 基于門水平泡鳳頭姜鹽水的細菌菌群結構

本研究將有效序列按照97%的相似度劃分共得到10 513個OTU，去除36個嵌合體OTU后，余下10 477個OTU，挑選代表性序列在數據庫中進行比對后，將其鑒定到19個門、46個綱、96個目、163個科和393個屬，其中分別有0.05%和7.45%的序列無法鑒定到細菌門和屬水平。本研究將平均相對含量大于1.0%的細菌門和屬分別定義為優勢細菌門和優勢細菌屬，泡鳳頭姜鹽水樣品中優勢細菌門的相對含量及分布情況見圖2。

圖2 泡鳳頭姜鹽水樣品中優勢細菌門相對含量的分析結果Fig.2 Analysis results of relative content of dominant bacterial phyla in fermented Fengtou ginger brine samples

由圖2可知，6個泡鳳頭姜鹽水中的優勢細菌門分別為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria），其平均相對含量分別為54.25%、40.26%、3.24%和1.76%。值得注意的是，Proteobacteria在樣品PJ4中的相對含量高達86.11%，而其在樣品PJ3中的相對含量僅為24.50%，Firmicutes在樣品PJ3和PJ4中亦存在與Proteobacteria同樣的差異。由此可見，盡管優勢細菌門在所有樣品中均存在，但不同細菌門在各個樣品中的含量差異較大。

2.2.2 基于屬水平泡鳳頭姜鹽水的細菌菌群結構

泡鳳頭姜鹽水樣品中優勢細菌屬的相對含量及分布情況見圖3。

由圖3可知，6個泡鳳頭姜鹽水樣品中的優勢細菌屬主要為隸屬于Firmicutes的乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和乳球菌屬（Lactococcus），其平均相對含量分別為27.73%、7.67%和3.31%；隸屬于Proteobacteria的假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、羅爾斯通菌屬（Ralstonia）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、拉恩氏菌屬（Rahnella）、弧菌屬（Vibrio）、腸桿菌屬（Enterobacter）、克呂沃氏菌屬（Kluyvera）、果膠桿菌屬（Pectobacterium）和歐文氏菌屬（Erwinia），其平均相對含量分別為5.99%、5.67%、5.34%、3.91%、2.60%、2.03%、1.88%、1.78%、1.32%和1.02%；隸屬于Bacteroidetes的黃桿菌屬（Flavobacterium），平均相對含量分別為1.06%。由此可見，Lactobacillus是泡鳳頭姜鹽水中主要的細菌類群。值得注意的是，其中屬于乳酸菌類群的有Lactobacillus和Lactococcus兩個屬，累計平均相對含量為31.04%。XIONG T等[19]對泡菜發酵過程中乳酸菌菌群的動態變化進行了跟蹤，結果發現明串珠菌屬（Leuconostoc）和Enterococcus出現在發酵的最早期，其他乳酸菌種類在發酵前期開始陸續出現并增殖，到了發酵中期部分乳酸菌開始消亡，而Lactobacillus一直存在至發酵終期。與此同時，XIONG T等[20]還研究了鹽濃度對泡菜發酵的影響，結果發現高濃度鹽會延緩泡菜的發酵進程，同時減少乳酸菌含量。因而，本研究泡鳳頭姜鹽水中乳酸菌種類少且含量較低這一現象可能是由于納入的部分樣品已處于發酵后期階段，亦或是當地人制作的泡鳳頭姜鹽濃度較高。后期可結合泡鳳頭姜的感官和理化指標展開研究，以期探究泡鳳頭姜鹽水與其他泡菜鹽水中菌群存在差異的具體原因。

圖3 泡鳳頭姜鹽水樣品中優勢細菌屬相對含量的分析結果Fig.3 Analysis results of relative content of dominant bacterial genera in fermented Fengtou ginger brine samples

除此之外，由圖3還可發現，泡鳳頭姜鹽水樣品中存在著一定的條件致病菌，如Pseudomonas[21]、Acinetobacter[22]和Enterobacter[23]等，目前已有大量研究證明這些菌屬中的部分菌種具有一定的感染性和導致炎癥的可能性。究其原因，可能是與制作環境開放以及原料和器具上有害微生物進入了發酵壇中有關，從而導致泡鳳頭姜鹽水中微生物類群被污染。因此，解析泡鳳頭姜鹽水的細菌群落結構對泡鳳頭姜的產業化生產和降低其中存在的安全隱患具有重要作用。

2.2.3 基于OTU水平泡鳳頭姜鹽水的細菌菌群結構分析

在對泡鳳頭姜鹽水細菌類群進行揭示的基礎上，本研究進一步對每個樣品的OTU數量和序列相對含量進行了統計分析，進而對6個泡鳳頭姜鹽水樣品特有和共有細菌類群的含量進行解析，結果見圖4。

由圖4可知，去除嵌合體后余下的10 477個OTU中，有7 841個OTU僅出現在一個樣品中，占OTU總數的74.85%，但其包含的序列數僅占總序列數的7.35%；而在所有樣品中均出現的OTU有105個，僅占OTU總數的1.00%，但其包含的序列數卻占總序列數的41.01%。本研究將在所有樣品中均出現的OTU定義為核心OTU。核心OTU中分別有22和12個OTU隸屬于Pseudomonas和Lactobacillus，包含的序列數分別占總序列數的2.98%和21.26%。由此可見，盡管每個樣品各自都擁有著較多的獨特OTU數量，但他們之間仍存在著大量以Lactobacillus為主的核心菌群。

圖4 樣品中OTU出現次數與其包含序列的相對含量Fig.4 Occurrences frequency and relative content of the contained sequences of OTU

本研究將在每個樣品中均存在且平均相對含量大于1.0%的OTU定義為核心優勢OTU，泡鳳頭姜鹽水中的核心優勢OTU及其平均相對含量見圖5。

由圖5可知，泡鳳頭姜鹽水樣品中的核心優勢OTU共有7個，分別為OTU7000、OTU6739、OTU6119、OTU6052、OTU2462、OTU2090和OTU1837，平均相對含量分別為1.63%、1.07%、2.10%、15.49%、1.48%、1.42%和2.31%，累計平均相對含量為25.49%。經序列比對發現，OTU6052和OTU2462中代表性序列被鑒定為隸屬于Lactobacillus，累計平均相對含量為16.97%，由此可見，Lactobacillus是泡鳳頭姜鹽水中的核心細菌屬，這與圖2的結果相一致。本研究進一步對核心優勢OTU間的相關性進行分析，結果見圖6。

圖6 核心優勢OTU的相關性熱圖Fig.6 Heat map of correlation analysis of core dominant OTU

由圖6可知，OTU1837（Rahnella）與OTU2462（Lactobacillu）和OTU6739（Pectobacterium）均呈現顯著正相關（P＜0.05），OTU7000（Aeromonas）與OTU2090（Enterobacter）呈現極顯著正相關關系（P＜0.01）。由此可見，泡鳳頭姜鹽水樣品中的部分核心細菌類群可能存在共生關系。

2.3 PICRUSt基因功能預測

使用PICRUSt軟件對泡鳳頭姜鹽水樣品中的細菌菌群基因功能進行預測，根據蛋白質直系同源簇數據庫（clusters of orthologous groups of proteins，COG）進行功能注釋[24]。本研究共注釋到3 567個COGs，所有的COGs分別隸屬于20個功能大類，其結果見圖7。

圖7 泡鳳頭姜鹽水樣品中細菌基因功能的預測結果Fig.7 Prediction results of bacterial gene function in fermented Fengtou ginger brine samples

由圖7可知，泡鳳頭姜鹽水樣品中細菌的基因主要富集在氨基酸轉運與代謝、碳水化合物運輸和代謝以及能量生產和轉換功能上，而在核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）加工與修飾以及細胞運動相關的基因功能上富集量較低。乳酸菌作為泡菜發酵過程中的主要微生物，在發酵過程中會產生大量有機酸和氨基酸等代謝物質[25]，這些代謝物質的產生可能是泡鳳頭姜鹽水中細菌類群在氨基酸轉運與代謝功能上有著較高表達的原因。

3 結論

本研究利用MiSeq高通量測序技術對來鳳地區泡鳳頭姜鹽水樣品細菌類群進行分析發現，泡鳳頭姜鹽水樣品中的細菌菌群歸屬于19個門、46個綱、96個目、163個科和393個屬；優勢細菌門為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria），其平均相對含量分別為54.25%、40.26%、3.24%和1.76%；優勢細菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、羅爾斯通菌屬（Ralstonia）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、乳球菌屬（Lactococcus）、拉恩氏菌屬（Rahnella）、弧菌屬（Vibrio）、腸桿菌屬（Enterobacter）、克呂沃氏菌屬（Kluyvera）、果膠桿菌屬（Pectobacterium）、黃桿菌屬（Flavobacterium）和歐文氏菌屬（Erwinia），其平均相對含量分別為27.73%、7.67%、5.99%、5.67%、5.34%、3.91%、3.31%、2.60%、2.03%、1.88%、1.78%、1.32%、1.06%和1.02%；Lactobacillus為泡鳳頭姜鹽水樣品中主要的核心細菌類群，累計相對含量達到16.97%；經PICRUSt基因功能預測發現，泡鳳頭姜鹽水樣品中細菌的基因主要富集在氨基酸轉運與代謝、碳水化合物運輸和代謝以及能量生產和轉換功能上。由此可見，來鳳地區泡鳳頭姜鹽水中細菌類群多樣性較高，且富含Lactobacillus。