枯草芽孢桿菌ZX-11培養條件及抑菌性能研究

王宏浩，張高瑜，逯夢凡，孟慶偉，趙素娟，劉金龍*

（1.河北科技大學 食品與生物學院，河北 石家莊 050018；2.河北省（保定）農用微生物菌種產業技術研究院，保定 071000；3.河北省動物微生態制劑產業技術研究院，河北 石家莊 050018）

隨著當前抗生素在動物飼料中不合理使用后負面現象的頻繁顯露，導致其在動物機體內大量殘留并通過食物鏈引起食品安全問題，間接使人們的生命健康受到食源性致病菌的威脅以致安全得不到有效的保障[1-3]。有研究發現，中國部分兒童尿液中至少含有一種乃至多種金霉素、恩諾沙星、泰樂菌素等只限用于畜禽的抗生素。因此，國際上關于在養殖環節中濫用抗生素的法律法規開始減少，甚至有些法律法規明文禁止在養殖環節中濫用抗生素[4]。至此，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為自然界中廣泛存在的有益菌型之一[5]，開始成為安全高效的天然替抗產品及研究熱點逐漸進入我國畜禽養殖行業的視野[6-7]。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為一種新的綠色益生菌型飼料添加劑，被我國農業部允許使用并獲得歐洲食品安全局（European food safety authority，EFSA）以及美國食品和藥物管理局（food and drug administration，FDA）的雙重安全認證[8-11]，其在發酵過程中會產生某種具有抑菌作用的代謝產物，如枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素等細菌素；蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等較強活性酶類；同時還有小分子抗菌肽、抗菌蛋白、多糖等多種抑菌物質[12]，其中天然抗菌肽是動物機體產生的主要抑菌物質，但其自身產生的抗菌物質濃度較低不能起到抑制致病菌生長的作用，所以針對微生物發酵通過菌體自身分泌安全高效的抑菌物質是當務之急[13]，并使之成為抗菌肽生產的有效途徑，對生物飼料工業發展的促進具有極其重要的意義[14-15]。

本實驗所用的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ZX-11是由本實驗室在河北科星藥業有限公司提供的雞糞便中篩選出來的可飼用益生菌，前期針對該菌種進行了篩選、鑒定及抑菌性能等多項研究，結果表明，枯草芽孢桿菌ZX-11發酵液中能夠產生抑制大腸桿菌的代謝產物，通過進一步的研究發現，該發酵液中的代謝產物蛋白起主要抑菌作用，而抗菌蛋白在動物飼料研發以及在生物防治等多方面具有一定研究意義[16-17]。長期以來，研究益生菌活菌制劑的有關報道較多[18-19]，但由于其代謝產物抑菌性能較低，同時針對其活性代謝產物的研究相對較少[20]。本實驗針對枯草芽孢桿菌ZX-11的培養條件進行了優化，從而提高枯草芽孢桿菌的抑菌性能，以期為其后期抑菌物質的分離、純化與結構鑒定奠定扎實的理論基礎[21]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ZX-11：河北科技大學食品與生物學院工業微生物技術研究室篩選；黑曲霉（Aspergillus niger）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、酵母菌、大腸桿菌（Escherichiacoli）、血清型致病菌、沙門氏桿菌（Salmonella enterica）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：均保存于河北科技大學食品與生物學院工業微生物技術研究室。

1.1.2 試劑

蔗糖、葡萄糖、硫酸銨、甘油、NaCl、KCl、CaCl2（均為分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；酵母浸粉（生化試劑）：天津市永大化學試劑有限公司；胰蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；K2HPO4（分析純）：天津歐博凱化工有限責任公司；MgSO4（分析純）：天津市百世化工有限公司；糖蜜、淀粉、玉米粉、豆粕、豆餅粉（生化試劑）：河北科技大學實驗室；木瓜蛋白酶（80萬U/g）、蛋白酶K（30.3 U/mg）、胰蛋白酶（10 000 U/mg）、蛋白酶E（50 U/mg）、胃蛋白酶（30 U/mg）（均為生化試劑）：上海麥克林生化科技有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

種子培養基（LB液體培養基）：胰蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，pH值7.2±0.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

營養瓊脂培養基：蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，牛肉膏粉3.0 g/L，瓊脂15.0 g/L，pH值7.3±0.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

發酵培養基：酵母浸粉2.5 g/L，蔗糖8.6 g/L，胰蛋白胨8.4 g/L，NaCl 6.4 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH值7.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

PHS-3C pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；PX224ZH電子天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；LRH-250生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；MJ-54A高壓滅菌鍋：施都凱儀器設備（上海）有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；5804R冷凍離心機：上海洪紀儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌ZX-11種子液的制備

菌株的活化：將甘油管保藏的枯草芽孢桿菌ZX-11劃線接種于營養瓊脂培養基，32 ℃條件下培養28 h。

種子液的制備：將活化的單菌落接種到種子培養基中，32 ℃、200 r/min條件下培養28 h。

1.3.2 枯草芽孢桿菌ZX-11生長曲線及抑菌活性的測定

以2%（V/V）的接種量將種子液接種于發酵培養基中，裝液量為100 mL/250 mL，32 ℃、200 r/min條件下培養32 h，每隔2 h取樣，使用紫外分光光度計在波長600 nm處測定OD600nm值及抑菌活性。以培養時間（x）為橫坐標，OD600nm值（y）為縱坐標繪制枯草芽孢桿菌ZX-11的生長曲線。

1.3.3 枯草芽孢桿菌ZX-11發酵條件研究

以2%（V/V）的接種量將種子液接種到發酵培養基中，裝液量為100 mL/250 mL，32 ℃、200 r/min條件下培養28 h。在此基礎上分別考察不同初始pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、轉速（150 r/min、180 r/min、210 r/min、240 r/min、270 r/min）和培養溫度（28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃）對枯草芽孢桿菌ZX-11抑菌活性和OD600nm值的影響。

1.3.4 抑菌活性的測定

無菌上清液的制備：取100 mL發酵液在4 ℃條件下10 000 r/min離心20 min，取上清液，再經過0.22 μm濾膜過濾去除菌體，4 ℃保存備用。

抑菌活性的測定：吸取100 μL大腸桿菌指示菌液涂布于營養瓊脂培養基，采用平板打孔法在培養基打孔，孔徑為8 mm，每孔分別加入100 μL無菌上清液，37 ℃靜置培養24 h，每組三個平行，使用直尺測量并記錄抑菌圈直徑，當抑菌圈直徑＞8 mm，說明具有抑菌活性[22]。

1.3.5 抑菌廣譜的測定

用打孔器在涂有指示菌液平板的不同方向均勻打孔，并添加100 μL發酵上清液后放置恒溫培養箱，細菌在37 ℃恒溫條件下培養12 h，真菌在28 ℃恒溫條件下培養18～36 h，每組試驗重復3次，培養結束后測定抑菌活性。

1.3.6 抑菌物質穩定性的測定

熱穩定性：將無菌上清液分別于50℃、60℃、70℃、80℃、90 ℃、100 ℃水浴分別處理15 min、20 min、30 min，121 ℃處理20 min，冷卻至室溫后測其抑菌活性。

酸堿穩定性：將無菌上清液的pH值分別調至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，37 ℃溫育2 h，再調回至初始pH 6.8±0.2，測定抑菌活性。

蛋白酶穩定性：分別取0.1 mL質量濃度為5 mg/mL的木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、蛋白酶E、胃蛋白酶，分別加入0.4 mL無菌上清液，使不同酶在其最適pH值下反應，同時設不加酶的無菌上清液為空白組，加酶的生理鹽水為對照組，37 ℃溫育3 h后將pH調回最適pH值，測定抑菌活性[23]。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌ZX-11的生長曲線和抑菌活性

枯草芽孢桿菌ZX-11的生長曲線和抑菌活性曲線見圖1。

圖1 枯草芽孢桿菌ZX-11的生長曲線及培養過程中的抑菌活性Fig.1 Growth curve of Bacillus subtilis ZX-11 and its antibacterial activity during cult

由圖1可知，枯草芽孢桿菌ZX-11發酵過程中，其生長曲線與抑菌活性曲線呈半偶聯關系。發酵0～4 h時，菌株ZX-11生長緩慢，處于延滯期，未開始產生有關抑菌的代謝產物；發酵4～16 h時，菌株ZX-11快速生長，處于對數生長期，抑菌物質開始產生并隨著菌體濃度的增長快速上升；發酵16～28 h時，菌株ZX-11的生長基本趨于穩定，處于穩定期，相關抑菌的代謝產物抑菌性能基本趨于穩定；發酵28 h后，菌株ZX-11的生長開始下降，進入衰退期，但代謝產物的抑菌性能并未跟隨菌體濃度開始下降仍然保持其最高抑菌活性。

2.2 培養條件對枯草芽孢桿菌ZX-11生長及抑菌活性的影響

2.2.1 初始pH值對枯草芽孢桿菌ZX-11生長及抑菌活性的影響

初始pH值對枯草芽孢桿菌ZX-11生長及抑菌活性的影響見圖2。

圖2 初始pH值對枯草芽孢桿菌ZX-11生長（a）及抑菌活性（b）的影響Fig.2 Effect of initial pH on the growth (a) and antibacterial activity(b) of Bacillus subtilis ZX-11

由圖2可知，發酵28 h時，隨著初始pH值的升高，菌株ZX-11的OD600nm值及抑菌活性均呈先升高后下降的趨勢，當初始pH值為7.0時，菌株ZX-11的生長情況（OD600nm值7.42）及抑菌活性（抑菌圈直徑達26 mm）均最好，分析原因可能是初始pH值過高，發酵液整體的內環境呈堿性，降低了枯草芽孢桿菌ZX-11對營養物質的吸收及利用率，間接導致代謝產物的抑菌活性；初始pH值過低使發酵液整體環境呈現酸性，導致菌體多種酶的活性降低，從而影響菌體的生長狀況及抑制代謝產物的抑菌活性[24]。因此，確定枯草芽孢桿菌ZX-11的最適初始pH值為7.0。

2.2.2 接種量對枯草芽孢桿菌ZX-11生長及抑菌活性的影響

接種量對枯草芽孢桿菌ZX-11生長及抑菌活性的影響見圖3。

由圖3可知，發酵28 h時，隨著接種量的增大，菌株ZX-11的OD600nm值呈先升高后下降的趨勢，抑菌活性呈先升高后趨于穩定的趨勢，當接種量為4%時，菌株ZX-11的生長情況（OD600nm值7.73）及抑菌活性（抑菌圈直徑27 mm）均最好，分析原因可能是接種量過小，會導致發酵液中初始濃度偏低，延長菌體的發酵周期，降低菌體在單位時間內產抑菌物質的產量；接種量過大，會導致發酵液中初始菌濃度偏高，減小菌體擴增倍數，抑制菌體代謝生長，從而降低發酵液內細菌素的產生，還會導致菌體溶氧量的競爭性抑制，降低菌體產抑菌物質的活性[24]。因此，確定枯草芽孢桿菌ZX-11的最適接種量為4%。

圖3 接種量對枯草芽孢桿菌ZX-11生長（a）及抑菌活性（b）的影響Fig.3 Effect of inoculum on the growth (a) and antibacterial activity (b) of Bacillus subtilis ZX-11

2.2.3 轉速對枯草芽孢桿菌ZX-11生長和抑菌活性的影響

攪拌轉速的首要作用是調節培養基溶氧量，使枯草芽孢桿菌能夠得到充分的氧氣需求。轉速對枯草芽孢桿菌ZX-11生長及抑菌活性的影響見圖4。

圖4 轉速對枯草芽孢桿菌ZX-11生長（a）及抑菌活性（b）的影響Fig.4 Effect of rotate speed on the growth (a) and antibacterial activity (b) of Bacillus subtilis ZX-11

由圖4可知，發酵28 h時，隨著轉速的增加，菌株ZX-11的OD600nm值及抑菌活性呈先升高后下降的趨勢，分析原因可能是轉速過快會導致培養基內的各種營養物質混合不均勻，出現分層現象，無法充分滿足菌體生長的營養物質條件，從而導致菌體產生一定的機械損傷，造成發酵液內菌體大量衰亡現象，導致代謝產物的合成量過少；轉速過慢，溶氧量的供給不充足，培養基易形成沉淀，不利于菌體的生長和繁殖，代謝產物的合成量會大大減少[24]。當轉速達到210 r/min時，菌株ZX-11的生長情況最優（OD600nm值7.50），但當轉速達到240 r/min時，抑菌性能最強（抑菌圈直徑27 mm）。因此，在同一轉速條件下很難同時實現菌體生長和抑菌性能的最優化，基于枯草芽孢桿菌ZX-11菌體生長與抑菌物質合成的半偶聯特性，提出轉速的分階段調控策略，以實現發酵轉速結果的最優化。

2.2.4 培養溫度對枯草芽孢桿菌ZX-11生長及抑菌活性的影響

培養溫度對枯草芽孢桿菌ZX-11生長及抑菌活性的影響見圖5。

圖5 培養溫度對枯草芽孢桿菌ZX-11生長（a）和抑菌活性（b）的影響Fig.5 Effect of culture temperature on the growth (a) and antibacterial activity (b) of Bacillus subtilis ZX-11

由圖5可知，當菌體發酵環境處于28～34 ℃時，由于溫度相對較低，會延長菌體發酵時間，同時延遲枯草芽孢桿菌ZX-11的生長，嚴重影響到發酵的效率，從而對抑菌物質的合成有一定的影響；當菌體發酵環境處于40 ℃時，由于溫度過高會導致微生物體內的酶失活，發酵內環境的很多反應無法順利進行，以致降低抑菌物質合成的產量或改變其抑菌性能。當發酵溫度為37 ℃時，菌株ZX-11的生長情況最好。然而當發酵溫度為31 ℃時，菌株ZX-11的抑菌活性達到最優狀態，因此，在同一溫度條件下很難同時實現菌體生長和抑菌性能的最優化，基于枯草芽孢桿菌ZX-11菌體生長與抑菌物質合成的半偶聯特性，提出溫度的分階段調控策略，以實現發酵溫度結果的最優化。

2.2.5 兩階段培養模式對菌體生長和抑菌活性的影響

在前期研究的基礎上，設計兩階段培養模式，即發酵0～12 h，37 ℃、210 r/min條件下培養，使菌體快速繁殖；發酵12 h后，切換為31 ℃、240 r/min，強化抑菌物質合成。兩階段培養模式對菌體生長和抑菌活性的影響見圖6。

圖6 兩階段培養模式對枯草芽孢桿菌ZX-11生長和抑菌活性的影響Fig.6 Effect of two-stage culture pattern on the growth and antibacterial activity of Bacillus subtilis ZX-11

由圖6可知，在整個發酵過程中，枯草芽孢桿菌ZX-11的生長曲線呈典型的S曲線，發酵至28 h時，OD600nm值達7.614。在37 ℃、210 r/min條件下，枯草芽孢桿菌ZX-11發酵8 h時開始有抑菌性能并隨著時間的延長而緩慢增長，培養時間為12 h時切換培養條件為31 ℃、240 r/min，抑菌性能隨時間的延長而開始迅速增長，抑菌性能最終在20 h時逐漸趨于穩定，抑菌圈直徑為30 mm，比單一培養模式31 ℃、210 r/min，31 ℃、240 r/min，37 ℃、210 r/min，37 ℃、240 r/min分別提高15%、7%、20%和11%，比優化前（抑菌圈直徑20 mm）提高50%。結果表明，采用發酵溫度及轉速分階段調控策略可顯著提高合成抑菌物質的效率。

2.3 枯草芽孢桿菌ZX-11代謝產生抑菌物質的抑菌譜

枯草芽孢桿菌ZX-11對真菌、革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌的抑菌效果見表1。由表1可知，枯草芽孢桿菌ZX-11的抑菌譜比較廣，對各種霉菌、酵母、細菌均具有抑菌活性，且對致病性大腸桿菌的抑菌活性要明顯高于其他菌。

表1 枯草芽孢桿菌ZX-11代謝物的抑菌譜Table 1 Antibacterial spectrum of metabolites of strain ZX-11

2.4 枯草芽孢桿菌ZX-11代謝產生抑菌物質的穩定性

2.4.1 熱穩定性

枯草芽孢桿菌ZX-11無菌上清液的熱穩定性見表2。由表2可知，枯草芽孢桿菌ZX-11在50～70 ℃條件下均分別處理15 min、20 min、30 min后，不同處理時間下的抑菌性能均無明顯變化。在80 ℃和100 ℃條件下處理不同時間，抑菌圈直徑呈階梯性下降。121 ℃條件下處理20 min，抑菌活性喪失。結果表明，枯草芽孢桿菌ZX-11的無菌上清液具有較高的熱穩定性。

表2 抑菌物質的熱穩定性Table 2 Thermal stability of antibacterial substances

2.4.2 酸堿穩定性

枯草芽孢桿菌ZX-11無菌上清液的酸堿穩定性見圖7。

圖7 抑菌物質的酸堿穩定性Fig.7 Acid-base stability of antibacterial substances

由圖7可知，該抑菌物質在pH值為2～10時均無明顯變化，表明其在酸性、中性以及弱堿條件下穩定性較好，尤其能夠耐受較強的酸性，低pH對抑菌物質幾乎沒有影響[20，25]。但是在pH值為11（強堿）的條件下，抑菌性能下降。結果表明，枯草芽孢桿菌ZX-11發酵過程中所產生的抑菌物質具有較強的酸堿穩定性，尤其在酸性、中性及弱堿條件下穩定性更好。

2.4.3 蛋白酶穩定性

由表3可知，經過胰蛋白酶、蛋白酶E、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶處理的組分與對照組分相比抑菌活性影響較小。而蛋白酶K處理的組分與對照組分相比抑菌圈直徑顯著減小，說明該發酵過程中產生抑菌的代謝產物主要有小分子抗菌肽和蛋白類等物質。但仍有部分抗菌活性，可能存在多糖或者脂類等其他具有抗菌作用的代謝產物，或因蛋白酶的濃度較低、處理時間較短導致部分活性蛋白沒有失活。綜上可知，枯草芽孢桿菌發酵過程中產生的抑菌物質對蛋白酶具有一定的穩定性。

表3 抑菌物質的蛋白酶穩定性Table 3 Stability of bacteriostatic substance to protease

3 結論

通過對枯草芽孢桿菌ZX-11發酵條件的研究，確定最佳培養條件為：接種量4%、pH值7.0、培養時間18 h、兩階段培養模式（發酵0～12 h，37 ℃、210 r/min條件下培養，使菌體快速繁殖；發酵12 h后，切換為31 ℃、240 r/min，強化抑菌物質合成）。在此條件下，菌株ZX-11對大腸桿菌的抑菌性能（抑菌圈直徑30 mm）比優化前、單一培養模式31 ℃、210 r/min，31 ℃、240 r/min，37 ℃、210 r/min，37 ℃、240 r/min分別提高50%、15%、7%、20%和11%。菌株ZX-11的代謝產物具有較廣的抑菌譜，具有較強的耐酸、耐堿、耐高溫能力，且對蛋白酶具有一定的穩定性。該研究可為后續抑菌物質進一步的分離純化及抗菌蛋白的鑒定研究提供理論基礎，為其他枯草芽孢桿菌抑菌性能及其抑菌物質的研究提供借鑒。