實時熒光定量PCR法鑒定發酵乳中嗜熱鏈球菌

王青龍，貌 達，周燕霞，劉 凱，李 爽，楊 霞，王雨婷，王軍紅，蔡雪鳳*

（1.北京食品安全監控和風險評估中心（北京市食品檢驗所），北京 100094；2.中國計量科學研究院化學計量與分析科學研究所，北京 100029）

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）是發酵乳中常用的益生菌種之一，雖然屬于鏈球菌屬，但其是鏈球菌屬內唯一對人體健康有益的乳酸菌[1]。嗜熱鏈球菌在美國具有“公認安全性（generally recognized as safe，GRAS）”，并且具有非常悠久的使用歷史[2]。在乳品發酵工業中是僅次于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的一種非常重要的乳酸菌。含有嗜熱鏈球菌的乳制品全球每年消費市場約400億美元[2]。嗜熱鏈球菌已經被列入國食藥監注[2005]第202號發布的《可用于保健食品的益生菌名單》中，同時已經被國家衛生部列入《可用于食品中的菌種名單》（衛辦監督發[2010]65號），說明該菌在具有保健性質的益生效果的同時具有食品方面的益生作用。研究表明，嗜熱鏈球菌在發酵過程中可以分泌多種功能活性物質，如雙乙酰、胞外多糖、細菌素和維生素等[3-6]；可以通過有機酸代謝等方式降低體內的膽固醇[7-9]。此外，其可以與保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）進行協同發酵，并且其分泌物能夠刺激嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）的生長，因此在發酵乳發酵過程中其經常被用作引子與保加利亞乳桿菌和瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）混合發酵風味發酵乳[10-13]。

乳酸菌菌種的選擇決定了發酵乳的風味和益生效果，準確的使用優質的乳酸菌是獲得優質發酵乳的關鍵技術[14-15]，因此，對乳酸菌菌種的鑒定具有重要的意義。乳酸菌菌株相似性較高，所以對乳酸菌的鑒定也是研究的難點。目前常用的鑒定方法是菌落形態觀察、鏡檢及生理生化試驗方法，該方法實驗步驟繁瑣，穩定性差，對檢驗員的技術和經驗要求較高。因此，建立一種快速穩定可靠的鑒定方法在以后的食品檢測和微生物分類的研究中是非常必要的。實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-fqPCR）法是目前技術成熟、結果穩定可靠的微生物菌種鑒定的方法，目前，已有大量研究采用該方法對發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentium）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracei）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）等[16-20]進行鑒定和定量研究。以16S rRNA基因為基礎的生物信息學及菌種鑒定是目前研究最多的分子生物學菌種鑒定方法，董銀蘋等[21]使用16S rRNA基因對乳酸桿菌和嗜熱鏈球菌進行鑒定并取得了可靠的結果；STACHELSKA M A等[22]根據16S rRNA基因設計引物對德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）和嗜熱鏈球菌進行定量分析，取得了與平板計數方法相似的結果。因此，建立一種RT-fqPCR方法用于鑒定嗜熱鏈球菌是可行且非常必要的。

有文獻[23]報道，16S rRNA基因屬內親緣關系較近的種間相似度通常會＞99%，因此，在進行菌種水平的鑒定時會很難進行區分。本研究通過基因發育樹分析確定目標基因，建立一種實時熒光定量PCR法對發酵乳中嗜熱鏈球菌進行鑒定，并通過特異性實驗、靈敏度實驗和抗干擾實驗驗證該方法的穩定性和準確性，以期為發酵乳樣品中嗜熱鏈球菌的檢測和菌種鑒定提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

60份發酵乳樣品：市售，所有樣品標簽標示含有嗜熱鏈球菌。

1.1.2 菌株

本實驗所用菌株均購自中國工業微生物菌種保藏管理中心（China center of industrial culture collection，CICC），菌株信息見表1。

表1 本研究所用菌株信息Table 1 Information of strains used in the study

1.1.3 試劑

MC瓊脂培養基：北京路橋技術有限公司；細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、蛋白酶K（20 mg/mL）、溶菌酶（50 mg/mL）：天根生化科技有限公司；Taqman master mix：美國ABI公司。

1.2 儀器與設備

ABIQuantStudio 7實時熒光定量PCR儀：美國ABI公司；VITEKCompac微生物分析系統：法國生物梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 目的基因的確定

根據文獻[24-27]確定選取16S rRNA、16S-23S rRNA、hsp60和recA等基因作為候選目標基因，在美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）網站下載候選目標基因序列，采用DNAMAN軟件進行序列比對。選取在鏈球菌屬間具有很好的種間特異性的基因作為目的基因，采用MEGAX生物學軟件構建系統發育樹。

1.3.2 引物和探針的設計

使用Primer Express V3.0設計目的基因的引物和探針，設計得到的引物探針在NCBI網站進行primerBlast，選出特異性較好的引物、探針委托上海生物工程有限公司合成。引物及探針序列見表2。

表2 實時熒光PCR引物和探針序列Table 2 Sequences of primers and probes of real-time fluorescence PCR

1.3.3 菌株活化

將冷凍干燥的2株嗜熱鏈球菌標準菌株首先轉接于MC瓊脂培養基中，37 ℃需氧培養（48±2）h，轉接兩代回復活力，用于后續實驗。

1.3.4 DNA提取

按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取表1中細菌的基因組DNA。

1.3.5 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR擴增體系：2×master mix 12.5 μL、引物對StF和StR（10 μmol/L）各1 μL、探針StP（10 μmol/L）0.5 μL、模板DNA 1 μL、雙蒸水（ddH2O）9 μL。

實時熒光定量PCR擴增參數：50℃、2min，95℃、10 min，95 ℃、5 s，60 ℃、40 s；同時收集羧基熒光素熒光，進行40個循環，4 ℃保存反應產物。

實時熒光定量PCR擴增曲線指數期明顯，Ct值＜35可直接判定為陽性，Ct值為35～40判定為可疑，需要進行重復實驗，Ct值＞40判定為陰性。

1.3.6 實時熒光定量PCR擴增特異性實驗

以2株嗜熱鏈球菌及表1中其他細菌DNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增。

1.3.7 實時熒光定量PCR擴增靈敏性實驗

靈敏度實驗包括絕對靈敏度和相對靈敏度實驗[28]。絕對靈敏度實驗：將提取得到的嗜熱鏈球菌CICC6063 DNA溶液稀釋至10 ng/μL、1 ng/μL、0.1 ng/μL、0.01 ng/μL、0.001 ng/μL、0.000 5 ng/μL、0.000 1 ng/μL。所有稀釋液在同一條件下進行實時熒光定量PCR擴增。相對靈敏度實驗：將嗜熱鏈球菌CICC6063添加到巴氏滅菌的發酵乳中，添加菌落數分別為107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、10 CFU/mL，使用細菌基因組提取試劑盒提取DNA后進行實時熒光定量PCR擴增。靈敏度實驗每個反應設置5個平行，重復實驗4次，記錄陽性擴增次數。

1.3.8 實時熒光定量PCR抗干擾實驗

對本次建立方法的抗干擾實驗設計了基因組水平的抗干擾實驗和培養物水平的抗干擾實驗。

基因組水平的抗干擾實驗：將嗜熱鏈球菌CICC6063的DNA分別稀釋至10 ng/μL、1 ng/μL、0.1 ng/μL、0.01 ng/μL，分別按照1∶1的體積比添加10 ng/μL的大腸桿菌ATCC25922 DNA或TE緩沖液，以混合后的DNA作為模板進行實時熒光定量PCR擴增，陰性對照以10 ng/μL大腸桿菌ATCC25922基因組作為模板，陽性對照以10 ng/μL嗜熱鏈球菌CICC6063基因組作為模板，空白對照以無菌水作為模板。記錄干擾DNA對實驗結果的影響。

培養物水平的抗干擾實驗：將嗜熱鏈球菌CICC6063培養液的菌體濃度稀釋到107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL，分別按照1∶1的體積比添加107CFU/mL的大腸桿菌ATCC25922或無菌水，充分混勻后，按照細菌DNA提取試劑盒的說明書提取DNA，然后進行實時熒光定量PCR擴增，陰性對照以107CFU/mL大腸桿菌ATCC25922作為模板，陽性對照以107CFU/mL嗜熱鏈球菌CICC6063作為模板，空白對照以無菌水作為模板記錄非特異性菌對實驗結果的影響。

1.3.9 市售樣品的檢測

將購買得到的發酵乳樣品按照國標GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》的方法進行培養，從每個樣品的MC平板上挑取10個菌落，使用細菌DNA提取試劑盒提取DNA，將該DNA作為模板進行實時熒光定量PCR擴增，記錄陽性擴增樣品數。

2 結果與分析

2.1 系統發育分析結果

通過分析發現recA基因在鏈球菌屬間具有很好種間特異性，基于recA基因構建嗜熱鏈球菌、前庭鏈球菌、唾液鏈球菌、乳桿菌屬等菌株的系統發育樹，結果見圖1。由圖1可知，嗜熱鏈球菌與前庭鏈球菌、唾液鏈球菌和乳桿菌等菌株具有比較大的差異，其種間差異率＞10%。說明recA基因能夠很好的用于嗜熱鏈球菌和乳桿菌屬等菌株的菌種鑒定和區分，較之16S rRNA具有更高的分辨率[23，29]。

圖1 基于recA基因序列21株菌株的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 21 strains based on recA gene sequence

2.2 實時熒光定量PCR擴增法鑒定嗜熱鏈球菌的特異性驗證結果

實時熒光定量PCR擴增法鑒定嗜熱鏈球菌的特異性驗證結果見圖2。

圖2 實時熒光定量PCR擴增法鑒定嗜熱鏈球菌的特異性實驗結果Fig.2 Specificity test results for Streptococcus thermophilus identification by real-time fluorescence quantitative PCR amplification method

由圖2可知，以嗜熱鏈球菌DNA為模板的實時熒光定量PCR具有明顯的擴增曲線，以其親緣關系較近的其他乳酸菌和食品中常見的細菌DNA為模板的實時熒光定量PCR均無熒光擴增信號。由此可以判斷，本研究建立的實時熒光定量PCR方法能夠特異性的擴增嗜熱鏈球菌的recA基因序列。

2.3 實時熒光定量PCR擴增法鑒定嗜熱鏈球菌的靈敏性驗證結果

2.3.1 絕對靈敏度驗證

實時熒光定量PCR擴增法鑒定嗜熱鏈球菌的絕對靈敏度實驗結果見表3。

表3 實時熒光定量PCR擴增法鑒定嗜熱鏈球菌的絕對靈敏度實驗結果Table 3 Absolute sensitivity test results for Streptococcus thermophilus identification by real-time fluorescence quantitative PCR amplification method

由表3可知，嗜熱鏈球菌CICC6063可穩定檢出的質量濃度為0.000 5 ng/μL，表示檢測下限可以達到1 pg/μL。結果表明，本研究建立的實時熒光定量PCR方法的絕對靈敏度為1 pg/μL。

2.3.2 相對靈敏度驗證

實時熒光定量PCR擴增法鑒定嗜熱鏈球菌的相對靈敏度實驗結果見表4。

表4 實時熒光定量PCR擴增法鑒定嗜熱鏈球菌的相對靈敏度實驗結果Table 4 Relative sensitivity test results for Streptococcus thermophilus identification by real-time fluorescence quantitative PCR amplification method

由表4可知，可以穩定檢出的最低菌落濃度為103CFU/mL。結果表明，本次建立的實時熒光定量PCR方法的相對靈敏度為103CFU/mL。

2.4 實時熒光定量PCR擴增法鑒定嗜熱鏈球菌的抗干擾能力驗證結果

2.4.1 基因組水平的抗干擾實驗結果

基因組水平的抗干擾實驗結果見表5。由表5可知，在干擾基因組濃度是目標基因組濃度1 000倍的情況下，Ct值無顯著影響（P＞0.05），因此可以看出，本研究建立的方法具有很好的抗干擾能力。

表5 基因組水平實時熒光定量PCR擴增法鑒定嗜熱鏈球菌的抗干擾實驗結果Table 5 Anti-disturbance test results for Streptococcus thermophilus identification by real-time fluorescence quantitative PCR amplification method at the level of the genome

2.4.2 培養物水平的抗干擾實驗結果

培養物水平的抗干擾實驗結果見表6。由表6可知，在干擾菌濃度達到目標菌濃度1 000倍的情況下，Ct值無顯著影響，均不影響嗜熱鏈球菌的檢出，由此可以看出，本研究建立的實時熒光定量PCR方法在培養物水平上具有很好的抗干擾能力。

表6 培養物水平實時熒光定量PCR擴增法鑒定嗜熱鏈球菌的抗干擾實驗結果Table 6 Anti-disturbance test results for Streptococcus thermophilus identification by real-time fluorescence quantitative PCR amplification method at the culture level

2.5 市售樣品中嗜熱鏈球菌的檢測結果

使用本研究建立的實時熒光定量PCR擴增方法對市售的60份表示含有嗜熱鏈球菌的發酵乳樣品進行檢測，檢測結果顯示均檢出嗜熱鏈球菌。

3 結論

本研究基于recA基因序列對嗜熱鏈球菌、前庭鏈球菌、唾液鏈球菌、乳桿菌屬等菌株構建系統發育樹發現，種間差異率＞10%，說明該基因可以用于嗜熱鏈球菌的特異性鑒定。使用該基因設計引物和探針，建立了一種可用于發酵乳中嗜熱鏈球菌檢測的實時熒光定量PCR擴增方法，通過特異性、靈敏性及抗干擾實驗驗證該方法能夠特異性的對發酵乳中的嗜熱鏈球菌進行檢測，并且具有很好的重復性和穩定性；絕對靈敏度可達到1 pg/μL，相對靈敏度可以達到103CFU/mL；在菌種水平和DNA水平都具有非常好的抗干擾能力。對市售的發酵乳樣品的檢測結果表明，60份標示添加嗜熱鏈球菌的發酵乳樣品均能檢測到嗜熱鏈球菌成分，說明該方法具有很好的實用性。本研究建立的方法可以為以后發酵乳樣品中嗜熱鏈球菌的檢測提供技術支撐，recA基因具有很好的菌種特異性，為以后乳桿菌或雙歧桿菌的鑒定提供了一定的參考數據。