酵母菌混合發酵制備米酒及其工藝優化

王奇盛，高瑞杰，繆禮鴻，廖衛芳，鄧 燦，陳家暉，范培文

（武漢輕工大學 生命科學與技術學院，湖北 武漢 430023）

傳統米酒是以糯米為主要發酵原料，添加酒曲釀造而成。米酒酒曲中的酵母主要包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）[1]和扣囊覆膜酵母（Saccharomyces fibuligera）[2]等，其作為發酵米酒的主要微生物，對米酒風味特征的影響一直是米酒釀造的研究熱點[3-6]。高級醇作為酒精飲料的主要風味之一，對于米酒的風味具有重要貢獻。米酒中的高級醇主要由異丁醇、異戊醇和β-苯乙醇組成。高級醇[7]是導致酒精飲料“上頭”的關鍵物質。其中，β-苯乙醇[8]、異戊醇[9]和異丁醇是影響醉酒速率的關鍵化合物[10]。通過傳統固態方法釀造出的米酒高級醇含量通常在245～498 mg/L之間，而啤酒的高級醇含量通常在55～94 mg/L之間[11]，與口味清爽的啤酒相比，米酒的高級醇含量過高會使酒體呈現苦味等不良風味[12]，且具有較強的致醉性。在實驗室中采用液態發酵的方法有助于降低米酒中高級醇的含量，具有非常重要的現實意義。

米酒發酵過程中的主要酵母菌S.cerevisiae、W.anomalus和S.fibuligera都具有產生高級醇的能力[13]。徐銀等[14]在小曲酒固態發酵中添加W.anomalus提高了其乙酸乙酯產量，降低了雜醇含量。S.fibuligera的主要代謝產物包括β-苯乙醇、乙酸苯乙酯等，對風味物質的形成有一定的作用[15]。白夢洋等[16]將W.anomalus和S.cerevisiae混合發酵，與純發酵相比，混合發酵產生了更高濃度、更多種類的風味物質。酵母菌混合發酵可提高果酒的酯類和風味物質含量。

在米酒發酵中，酵母接種量、后發酵溫度和后發酵時間是影響米酒質量的關鍵因素。曾朝珍等[17]研究發現，高級醇含量會隨著接種量的提高而升高；溫度影響發酵過程中細胞質膜的流動性、酶的活性及物質的溶解度等，在釀酒工藝中低溫發酵（10～16 ℃）是常見的發酵方式[18]，由于酵母的最適生長溫度是25～30 ℃，而在10～16 ℃發酵則有可能導致其生長緩慢與阻滯。張洋洋等[19]研究發現，醇、酯、醛、酸類等風味化合物隨糙米酒釀發酵時間增加種類先增后趨于穩定，可能是由于后期低溫環境有利于減少醛酮類物質的產生，可通過延長后期低溫發酵時間改善米酒質量。

本研究以異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、扣囊復膜酵母（Saccharomyces fibuligera）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為發酵菌株，采用液態發酵的方式對米酒進行發酵，對其發酵的米酒的揮發性風味物質及感官品質進行分析，并以感官評分和高級醇含量為考察指標，采用單因素試驗及響應面試驗對其發酵條件進行優化，以期降低米酒中的高級醇含量并提高品質，為米酒釀造的產業升級提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

糯米：市售；異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）LL-7、扣囊復膜酵母（Saccharomyces fibuligera）3-1[20]：本實驗室分離保存；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）H1：某酵母股份有限公司。

1.1.2 試劑

叔戊醇（純度99%）：上海麥克林生化科技有限公司；乙酸戊酯、2-乙基丁酸（純度均為99.5%）：成都艾科達化學試劑有限公司；乙酸乙酯、正丙醇、異戊醇、異丁醇、β-苯乙醇、乙酸（純度均為99.5%）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；耐高溫α-淀粉酶（酶活30 000 U/g）：夏盛（北京）生物科技開發有限公司；糖化酶（酶活100 000 U/g）、蛋白胨、酵母膏（均為生化試劑）：安琪酵母股份有限公司；葡萄糖、乳酸、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：天津科密歐化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，蒸餾水1 000 mL；YPD固體培養基：在YPD基礎上添加2%瓊脂粉。115 ℃高壓蒸汽滅菌25 min。

1.2 儀器與設備

UV-5900PC紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；7890A氣相色譜儀、J&WCP-Wax 57 CB色譜柱（50 m×0.25 mm，0.2 μm）：美國安捷倫科技有限公司；DNP-9082恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；EUG12PY-DEUG超純水機：上海陽淪精密設備科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

對實驗室保藏的W.anomalusLL-7、S.fibuligera3-1、S.cerevisiaeH1于YPD固體培養基活化，挑取單菌落到10 mL YPD培養基中，恒溫30 ℃，170 r/min搖床培養24 h，得到一級種子液。再取1 mL一級種子液到裝液量為100 mL/250 mL的YPD液體培養基中恒溫30 ℃、170 r/min搖床培養24 h，得到二級種子液，菌落數為3.76×106CFU/mL。

1.3.2 米酒的制備

稱取一定量的糯米，研磨成粉，過40目的篩。將糯米粉和水以料液比1∶3（g∶mL）混合，于65～90 ℃升溫時水浴加熱30 min糊化，90 ℃時加入耐高溫α-淀粉酶（20 U/g），并保溫90 min。冷卻后加入糖化酶（150 U/g），65 ℃保溫糖化30 min。整個過程中需要不斷攪拌，糖化冷卻后即為糯米糖化液，初始糖度為160 g/L，pH值為6.0。將二級種子液按5%的體積比接種糯米糖化液，搖勻后放入28 ℃靜置培養2 d進行前發酵，20 ℃靜置培養3 d進行后發酵，得到米酒。

1.3.3 酵母菌混合發酵米酒試驗設計

在米酒制備工藝的基礎上，考察不同菌種混合發酵對米酒品質的影響。將不同菌株的二級種子液以5%接種量（V/V）發酵制備米酒，混合發酵米酒菌株添加比例的試驗方案設計見表1。

表1 酵母菌混合發酵米酒菌株添加比例的試驗設計方案Table 1 Experimental design scheme of strain addition ratio of rice wine by mixed yeast fermentation

1.3.4 米酒發酵工藝優化

（1）單因素試驗

以高級醇含量和感官評分為考察指標，分別考察菌株接種量（2×106CFU/mL、3×106CFU/mL、4×106CFU/mL、5×106CFU/mL、6×106CFU/mL）、后發酵溫度（16 ℃、18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃）、后發酵時間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d）對發酵效果的影響。

（2）響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，進一步研究接種量（X1）、后發酵溫度（X2）、后發酵時間（X3）對高級醇含量（Y1）和感官評分（Y2）的影響，采用響應面試驗對米酒發酵工藝進行優化，Box-Behnken試驗設計因素及水平見表2。

表2 米酒發酵工藝優化Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for rice wine fermentation process optimization

1.3.5 分析檢測

總酸含量的測定：參照GB/T 13662—2018《黃酒》[21]；還原糖含量的測定[22]：采用DNS法。

乙醇含量及高級醇（正丙醇、異戊醇、異丁醇和β-苯乙醇）含量的測定[23]：采用氣相色譜法。

標準品的配制：將10 mL乙酸乙酯、正丙醇、異戊醇、異丁醇、β-苯乙醇、乙酸試劑添加到10 mL容量瓶中，并添加0.2 mL內標混合液（叔戊醇質量濃度324.71 mg/L、乙酸戊酯質量濃度352.94 mg/L、2-乙基丁酸質量濃度374.12 mg/L）。

樣品前處理：取發酵液和蒸餾水各100 mL于500 mL蒸餾瓶中蒸餾，收集前100 mL蒸出液，蒸餾液用0.45 μm水系膜過膜處理，取10 mL蒸餾液，添加溶液質量濃度分別為叔戊醇324.71 mg/L、乙酸戊酯352.94 mg/L、2-乙基丁酸374.12 mg/L的混合溶液20 μL/mL作內標物，混合均勻，采用氣相色譜儀測定。

氣相色譜條件：色譜柱為DB-FFAP（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為氮氣（N2）；儀器參數為：進樣量1 μL，分流比10∶1，氫氣（H2）流速為30 mL/min，空氣流速為400 mL/min，N2流速為1mL/min，進樣口溫度220℃，檢測器溫度為200℃，初始溫度為60 ℃，維持5 min，以10 ℃/min的上升速率升至160 ℃，維持5 min，總運行時間20 min。

定性定量方法：根據標準品在色譜圖上的保留時間進行定性，根據內標法進行定量。

1.3.6 感官評價

感官評價參照GB/T 13662—2018《黃酒》進行，9名品酒員從澄清度、色澤、香氣、滋味4個方面對米酒進行感官評價，滿分為100分。米酒感官評分標準見表3。

表3 米酒感官評價標準Table 3 Sensory evaluation standards of rice wine

1.3.7 數據處理

試驗重復3次，結果以“平均值±標準差”表示，制表軟件為Excel 2019，制圖軟件為Origin2021，響應面分析軟件為Design-Expert 8.0.6。

2 結果與分析

2.1 混菌組合對發酵米酒品質的影響

2.1.1 混菌組合對發酵米酒理化指標及感官評分的影響

混合發酵米酒的理化指標及感官評分標準見表4。

表4 混合發酵米酒的理化性質與感官評分Table 4 Physicochemical properties and sensory scores of rice wine fermented by mixed strains

由表4可知，4組合制備米酒的pH值差異不明顯，組合3制備米酒的總酸值最低（1.54 g/L），其原因可能是，接種W.anomaluLL-7導致米酒總酸值降低，與劉曉柱等[24]對異常威克漢姆酵母的實驗結果較為接近。組合1制備米酒總酸值最高（2.70 g/L）的原因可能是，菌株S.fibuligera3-1具有較強的產酸能力，對底物的利用較充分，這與王春曉等[25]對扣囊復膜酵母特性研究的結果較為相符；在多菌種發酵米酒中，3種酵母復合發酵的4號組合制備的米酒與未添加菌株S.fibuligera3-1的3號組合相比，總酸含量提高了28.6%，與未添加W.anomaluLL-7的2號組合制備的米酒相比，殘糖含量提高了10.6%，米酒酸甜度更為適中。在4個組合制備的米酒中，組合4號制備米酒的感官評分最高（87.3分），風味物質產出可能更佳，具有一定的研究價值。因此，菌株W.anomalusLL-7、S.fibuligera3-1、S.cerevisiaeH1混合發酵制備米酒效果較好。

2.1.2 混菌組合對發酵米酒揮發性風味物質的影響

組合1、組合2、組合3、組合4制備的米酒酒精度分別為3.03%vol、4.69%vol、4.13%vol、4.92%vol；由表5可知，與組合1相比，組合4制備的米酒的乙酸乙酯含量降低，可能是異常威克漢姆酵母與釀酒酵母組合發酵的抑制關系導致[26]；組合1、組合2、組合3、組合4制備的米酒總高級醇含量分別為72.14 mg/L、160.58 mg/L、106.25 mg/L、164.95 mg/L，與組合1相比，添加了釀酒酵母的組合4制備的米酒高級醇含量也明顯升高，可能在組合發酵中釀酒酵母是產出高級醇的主要菌株，與孫中貫等[27]在釀酒酵母高級醇代謝研究中的實驗結論相類似。乙酸具有刺激性酸味，在米酒中含量不宜過高，其中組合4制備的米酒乙酸含量最低，為97.17mg/L。

表5 混菌發酵米酒的揮發性風味物質分析結果Table 5 Analysis results of volatile flavor compounds in rice wine fermented by mixed strains mg/L

綜上，組合4制備的米酒酸甜度較為適中，具有果香等風味且不刺鼻，酒味濃郁，感官評分較高，因此選擇組合4（W.anomalusLL-7、S.fibuligera3-1、S.cerevisiaeH1（1∶1∶1））進行后續實驗。

2.2 米酒發酵工藝優化單因素試驗

2.2.1 接種量的確定

酵母接種量對發酵米酒品質的影響見圖1。由圖1可知，隨著接種量在2×106～6×106CFU/mL范圍內的不斷增加，高級醇含量不斷升高。當接種量在2×106～4×106CFU/mL范圍內，感官評分逐漸增加；當接種量為4×106CFU/mL，感官評分達到最高值，為90.5分；當接種量＞4×106CFU/mL，感官評分逐漸下降。與MATEO J J等[28]報道的雜醇油含量伴隨接種量提高不斷升高的結論類似。因此，最適接種量為4×106CFU/mL。

圖1 酵母接種量對米酒品質的影響Fig.1 Effect of yeast inoculum on the quality of rice wine

2.2.2 后發酵溫度的確定

后發酵溫度對發酵米酒品質的影響見圖2。

圖2 后發酵溫度對米酒品質的影響Fig.2 Effect of post fermentation temperature on the quality of rice wine

由圖2可知，隨著后發酵溫度在16～24 ℃范圍內的上升，高級醇含量不斷升高，但在溫度為20～24 ℃范圍內，高級醇含量上升較為緩慢，其原因可能是，較高溫度導致相關酶活性降低[29]。當后發酵溫度在16～20 ℃時，感官評分逐漸增加；當后發酵溫度為20 ℃時，感官評分達到最高值，為83.1分；當后發酵溫度高于20 ℃，感官評分逐漸下降。因此，最適后發酵溫度為20 ℃。

2.2.3 后發酵時間的確定

后發酵時間對發酵米酒品質的影響見圖3。由圖3可知，隨著后發酵時間在1～5 d范圍內的增加，高級醇含量不斷升高，其原因可能是，隨著時間的延長，發酵更為充分，與張洋洋等[19]在實驗中明確的米酒液態發酵中高級醇隨時間變化的規律一致。隨著后發酵時間在1～3 d范圍內的增加，感官評分逐漸增加；當后發酵時間為3 d時，感官評分達到最大值，為83.1分；當后發酵時間＞3 d，感官評分下降。因此，最適后發酵時間為3 d。

圖3 后發酵時間對米酒品質的影響Fig.3 Effect of post fermentation time on the quality of rice wine

2.3 米酒發酵工藝優化響應面試驗結果

2.3.1 Box-Behnken試驗結果與方差分析[31-32]

在單因素試驗的基礎上，以接種量（X1）、后發酵溫度（X2）、后發酵時間（X3）為自變量，以高級醇含量（Y1）和感官評價（Y2）為響應值。采用Box-Behnken試驗設計對米酒發酵工藝進行優化，Box-Behnken試驗設計及結果見表6，方差分析結果見表7。

表6 米酒發酵工藝優化Box-Behnken試驗設計及結果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation process optimization of rice wine

續表

運用Design Expert V8.0.6軟件對表7中的結果進行擬合分析，分別得到高級醇含量（Y1）、感官評分（Y2）與接種量（X1）、后發酵溫度（X2）、后發酵時間（X3）3個因素之間的二次回歸方程：

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

由表8可知，所建立的模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P＞0.05），回歸模型決定系數分別為R12=0.999 4、R22=0.999 0，調整決定系數R2Adj1=0.998 5、R2Adj2=0.997 6，說明高級醇和感官評分的變化分別有99.94%和99.90%來源于酵母接種量（X1）、后發酵溫度（X2）、后發酵時間（X3）3個因素，回歸模型與試驗擬合度良好，具有較高的可靠性，受未知因素影響較少。由P值可知，一次項X1、X2、X3、交互項X2X3、二次項X12、X22、X32對高級醇含量影響極顯著（P＜0.01），其他項對高級醇含量影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，試驗所選因素影響的強弱次序為：接種量（X1）＞后發酵時間（X3）＞后發酵溫度（X2）。

由P值可知，一次項X1、X2、X3、交互項X1X2、X1X3、X2X3、二次項X12、X22、X32對感官評分影響均極顯著（P＜0.01）。由F值可知，三個因素對感官評價的影響主次關系是后發酵溫度（X2）＞后發酵時間（X3）＞酵母接種量（X1）。

2.3.2 響應面交互作用分析

各因素交互作用對米酒高級醇含量和感官評分影響的響應面和等高線見圖4。由圖4A可知，后發酵溫度（X2）與后發酵時間（X3）的等高線呈橢圓形，響應曲面較陡峭，說明兩者交互作用對高級醇含量影響較大，達到極顯著效果（P＜0.01），而酵母接種量（X1）與后發酵時間（X3）、酵母接種量（X1）與后發酵溫度（X2）的等高線近似為圓形，交互作用不顯著（P＞0.05）。由圖4B可知，酵母接種量（X1）與后發酵時間（X3）、酵母接種量（X2）與后發酵時間（X3）、后發酵溫度（X2）與后發酵時間（X3）的等高線均呈橢圓形，響應曲面較陡峭，說明兩者交互作用對感官評分影響較大，交互作用顯著（P＜0.01）。這與方差分析結果一致。

圖4 各因素交互作用對高級醇含量（A）和感官評分（B）影響的響應曲面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of interaction between various factors on higher alcohols contents (A) and sensory scores (B)

2.3.3 模型驗證

利用Design Expert 8.0.6軟件對所得回歸方程進行回歸，以高級醇含量偏低，感官評價得分偏高為目標，確定米酒發酵工藝最佳條件為：接種量3.06×106CFU/mL、后發酵溫度20.85 ℃、后發酵時間2.31 d，在此優化條件下，高級醇含量的預測值為149.465 mg/L，感官評分預測值為88.552分?？紤]到實際操作的方便性，將發酵條件修正為：接種量3.0×106CFU/mL、后發酵溫度21 ℃、后發酵時間2.5 d。在此優化條件下進行3次平行驗證試驗，測得高級醇含量實際值為153.1 mg/L，感官評分實際值為90.1分，與模型預測值較為一致，證實該模型可靠。

3 結論

該研究將3株酵母菌W.anomalusLL-7、S.fibuligera3-1、S.cerevisiaeH1混合（1∶1∶1）發酵制備米酒，通過單因素試驗及響應面試驗得到米酒最佳發酵工藝為：接種量3×106CFU/mL、后發酵溫度為21 ℃、后發酵時間為2.5 d。在此優化條件下，米酒高級醇含量為153.1 mg/L，感官得分為90.1分。高級醇含量降低了7.2%，感官品質有所提升。組合發酵釀造出的米酒口感更佳，酒體品質更高，對液態發酵工藝的優化有助于控制微生物的發酵環境，縮短發酵時間，提高米酒品質，實現效益最大化。