香菇柄發酵醬營養品質及風味成分研究

程洋洋，惠靖茹，郝競霄，黃占旺

（江西農業大學 食品科學與工程學院 江西省天然產物與功能食品重點實驗室，江西 南昌 330045）

香菇（Lentinus edodes）又名花蕈、香信、冬菰，是世界上僅次于蘑菇的第二大食用菌，由于其味道鮮美、氣味怡人，在民間又被冠以“菇中皇后”的美稱，可見人們對香菇的喜愛程度[1-2]。同時又是一種食藥同源的食物，體內含有香菇多糖、有機堿、香菇嘌呤和一些礦物質元素，具有抗腫瘤[3]、增強免疫力[4]、抗氧化[5]、健脾保肝[6]、預防佝僂及貧血等功能[7]。據2019年統計數據顯示，香菇依然是我國產量最大的食用菌，年產量可達300萬t[8]。香菇柄是香菇在生產加工過程中的下腳料，香菇柄占整個香菇質量的25%～30%左右，產量較大。目前對香菇的應用主要集中在生物活性的提取、方便食品的研發等方面，但香菇調味品相關產品較少，覃財華[9]以香菇為原料，經復水工藝處理后，發現炒醬時間2.6 min，黃豆醬添加量56 g，辣椒添加量5.5 g時，香菇醬的感官評分為9.4分，成品色澤紅艷潤澤，香氣濃郁；程洋洋等[10]以糯米、黃豆為原料，選用米曲霉（Aspergillus oryzae）As3.04進行制曲制備香菇柄發酵醬糕。在單因素試驗的基礎上對發酵醬糕的制曲工藝進行響應面優化。結果表明，香菇柄發酵醬糕的制曲最優條件為糯米與黃豆質量比2∶3、米曲霉接種量0.8%、培養時間48 h、培養溫度30 ℃。此條件下成曲蛋白酶活力為2 625.48 U/g。

發酵醬是一種利用微生物發酵制成的調味品，在3000多年前的周朝便開始生產食用[11]。目前生產和食用發酵醬的地區主要分布在亞洲。不同原料和發酵工藝對發酵醬的營養成分、氨基酸組成、揮發性成分影響較大，其中氨基酸組成和揮發性成分是評價品質的關鍵指標。目前氨基酸組成測定方法較為統一，主要采用氨基酸自動測定儀，而揮發性成分的測定方法較多，主要有氣質聯用技術（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、氣相色譜-嗅聞儀（gas chromatograph-olfactometry，GC-O）等，部分研究還結合感官量化描述分析（quantitativedescriptiveanalysis，QDA）和相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）技術對揮發性成分進行研究[12-14]。這些檢測技術的特點是樣品用量少、少量的化學試劑和快速的色譜分離，缺點是前處理復雜、時間長、靈敏性較低，氣相-離子遷移譜（gas chro matography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）作為一種新型的風味物質分析手段，具有靈敏度高、選擇性強、操作簡單、檢測過程快速高效、儀器易攜帶、小型化等優點。

本研究使用香菇柄發酵醬與未添加香菇柄的傳統發酵醬為研究對象，并對其進行水分、還原糖、氨基酸態氮、紅色指數氨基酸等指標測定，采用氣相色譜-離子遷移譜聯用（GC-IMS）技術分析其揮發性風味成分，建立兩種發酵醬的風味指紋圖譜，以期為香菇柄的深加工及再利用及香菇柄發酵醬的產業化開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇柄發酵醬、傳統發酵醬：江西農業大學食品科學與工程學院制作。為保證測試樣品品質，發酵結束后取出冷卻至室溫，置于-18 ℃冰柜中保存備用。

3,5-二硝基水楊酸（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、鹽酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純）：阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

JH2102電子天平：上海精密科學儀器有限公司；GPX-9248A電熱鼓風干燥箱：上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；GDYQ-1000S醬油氨基酸態氮快速測定儀：長春·吉大小天鵝儀器有限公司；L-8900日立氨基酸自動分析儀：日本日立公司；FlavourSpec風味分析儀：德國G.A.S公司；MXT-5色譜柱（1 μm，0.53 mm×15 m）：美國RESTEK公司。

1.3 方法

1.3.1 香菇柄發酵醬與傳統發酵醬的加工工藝流程及操作要點

（1）香菇柄發酵醬加工工藝流程：

糯米、黃豆→接種→制曲→烘干、粉碎→成曲→香菇柄粉、成曲→攪拌→食鹽水→發酵→裝罐→滅菌→成品

（2）傳統發酵醬加工工藝流程：

糯米、黃豆→接種→制曲→烘干、粉碎→成曲→加食鹽水→發酵→裝罐→滅菌→成品

操作要點：

香菇柄粉的制備：去除雜質后洗凈，放在陰涼通風處晾干表面水分，放入105 ℃烘箱內烘6 h，取出粉碎過40目篩子，放入密封袋中陰涼干燥處備用。

制曲：黃豆與糯米按照一定的比例混合，浸泡12 h后撈出瀝干水分，在121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌15 min，取出后攤開放置于桌面自然冷卻至30 ℃以下，接種0.7%米曲霉As3.042，在30 ℃，培養48 h，中間進行兩次通風翻曲，曲料表面布滿黃綠色菌絲，完成制曲。

烘干、粉碎、成曲：將制曲過程中獲得的成曲40 ℃烘制24 h，取出粉碎過20目篩子，放入密封袋中4 ℃冰箱保存。

加食鹽水：稱取60 g的食用鹽放入燒杯中，加入1 000 g的蒸餾水溶解，得到6%食鹽水，于高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃滅菌10 min后冷卻。

發酵：將粉碎后的成曲與鹽水按1.0∶2.5的比例混合均勻并將密封后的發酵罐放置在恒溫培養箱中，50 ℃恒溫發酵20 d后取出裝罐。

滅菌：灌裝完成后的發酵醬進蒸屜排氣，排氣時迅速旋緊，高溫高壓滅菌（121 ℃、20 min），冷卻后即得香菇柄發酵醬與傳統發酵醬成品。

1.3.2 常規理化指標測定

水分含量測定：參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》。還原糖含量測定：參考GB/T 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》。氨基酸態氮含量測定：參照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態氮的測定》。紅色指數測定：紅色指數是豆醬色調表征方法之一，反映豆醬主要顏色的強弱，紅色指數越大，紅色色調越深。參照孫月琴[15]的方法并作修改。取0.5 g發酵醬，加入50 mL體積分數為70%乙醇溶液，60 ℃水浴1 h，冷卻后2 400 r/min離心15 min澄清。紫外分光光度計測定波長510 nm和610 nm處的吸光度值A1、A2，紅色指數計算公式如下：。氨基酸含量測定：參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》。

1.3.3 揮發風味成分的測定

樣品前處理：取發酵醬樣品后攪拌均勻，取1 g樣品置于20 mL頂空瓶中，55 ℃孵育20 min后進樣，每個樣品平行測定3次。

檢測條件：氣相-離子遷移單元：色譜柱柱溫60℃；MXT-5色譜柱（1 μm，0.53 mm×15 m）；漂移氣體為氮氣（N2）（純度＞99.999%）；IMS探測器溫度45 ℃，樣品分析時間20 min。

頂空進樣單元：孵化溫度55 ℃；孵化時間20 min；進樣體積200 μL；進樣針溫度85 ℃；孵化轉速500 r/min。

載氣流速條件：初始2 min流速保持為2 mL/min，10 min內流速線性增加至10 mL/min，接著在后續10 min內增加至100 mL/min結束。

1.3.4 數據處理

采用SPSS 26.0軟件進行數據統計分析；Microsoft Excel 2016軟件進行繪圖處理；氨基酸自動分析儀進行氨基酸組成與含量分析；樣品之間的揮發性物質定性分析、譜圖差異、揮發性有機物差異利用FlavourSpec機載插件進行分析。

2 結果與分析

2.1 香菇柄發酵醬與傳統發酵醬常規理化指標測定結果

水分、還原糖、氨基酸態氮含量和紅色指數是評價發酵醬的幾個重要指標。香菇柄發酵醬與傳統發酵醬理化指標測定結果見表1。由表1可知，香菇柄發酵醬中的水分（62.79%）和氨基酸態氮含量（0.76%）均低于傳統發酵醬，還原糖含量（21.12%）、紅色指數（1.44）均高于傳統發酵醬。從發酵醬理化指標來看，香菇柄發酵醬與傳統發酵醬品質基本無太大差別，說明添加制備香菇柄發酵醬可行，且其品質符合國標GB 2718—2014《釀造醬》的要求[16]。

表1 兩種發酵醬常規理化指標測定結果Table 1 Determination results of routine physical and chemical indexes of two kinds of fermented pastes

2.2 香菇柄發酵醬與傳統發酵醬氨基酸測定

2.2.1 氨基酸組成

2種發酵醬中氨基酸的組成和含量測定結果如見表2。

表2 兩種發酵醬中氨基酸含量測定結果Table 2 Determination results of amino acid contents in two kinds of fermented pastes

由表2可知，2種發酵醬中均檢測出17種氨基酸，其中包括10種非必需氨基酸（non-essential amino acid，NEAA）和7種必需氨基酸（essential amino acid，EAA）。2種發酵醬中含量較高氨基酸均為谷氨酸、脯氨酸、天冬氨酸。在必需氨基酸中，亮氨酸的含量在2種發酵醬中均最高，分別為6.76 mg/g、7.86 mg/g，含量最低的必需氨基酸在香菇柄發酵醬中是蘇氨酸，僅為3.53mg/g，傳統發酵醬中是甲硫氨酸，為3.90mg/g。傳統發酵醬的必需氨基酸、非必需氨基酸和總氨基酸含量（total amino acid，TAA）均高于香菇柄發酵醬，分別為87.71 mg/g、33.43 mg/g、54.28 mg/g。香菇柄發酵醬中的必需氨基酸與非必需氨基酸含量比值（EAA/NEAA）為61.59，滿足聯合國糧食及農業組織（food and agriculture organization of the united nations，FAO）/世界衛生組織（world health organization，WHO）模式中對EAA/NEAA的要求（60%以上）是優質蛋白來源。

2.2.2 呈味氨基酸

氨基酸不僅具有一定的生理功能，而且具有一定的呈味特性，正是這一特點才使得氨基酸類化合物在食品中的廣泛應用。根據氨基酸不同的呈味特性，主要分為四類氨基酸，分別是鮮味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸和芳香族氨基酸，有些還包括咸味氨基酸[17]。

如圖1所示，呈味氨基酸按照相對含量排列依次為鮮味、苦味、甜味和芳香族。鮮味氨基酸在2種發酵醬中的含量分別為36.681 mg/g、42.978 mg/g，也是含量最高的呈味氨基酸，可見作為傳統調味品的發酵醬在食用過程中主要是賦予鮮味；苦味氨基酸與甜味氨基酸在傳統發酵醬中質量分數相差不大，而在香菇柄發酵醬中二者相差2.877 mg/g；相較于其他三種氨基酸，芳香族氨基酸含量較低，僅為9.481 mg/g和9.708 mg/g。由此可見，2種發酵醬中氨基酸的組成比例類似，在各種呈味氨基酸的相互作用下，表現出相似并各具特點的呈味特性[18]。

圖1 兩種發酵醬中呈味氨基酸比較Fig.1 Comparison of flavor amino acids in two kinds of fermented pastes

2.3 香菇柄發酵醬與傳統發酵醬揮發性成分測定

2.3.1 香菇柄發酵醬與傳統發酵醬揮發性成分的二維圖譜

通過GC-IMS分析的兩種發酵醬中揮發性成分的二維譜圖見圖2。由圖2可知，整個二位圖譜的背景為深藍色，在橫坐標1.0處有一條紅色豎線為經歸一化處理后的反應離子峰（reaction ion peak，RIP），反應離子峰兩側分布著不同顏色且深度不一的斑點，每一個點代表一種揮發性有機物，顏色代表物質的濃度，顏色越深代表物質的濃度越大[19]；縱坐標為氣相色譜的保留時間（retention time，RT），橫坐標為離子遷移時間（drift time，DT）。同一種化合物可能會以單體、二聚體或多聚體形式出現，這是由于電離作用和物質的性質和濃度大小共同決定的[20]。從圖2可以看出，將傳統發酵醬譜圖為背景扣除時，香菇柄發酵醬譜圖中有很多紅色斑點，說明菇柄發酵醬中的部分風味物質比傳統發酵醬多。兩種發酵醬中的揮發性成分可通過GC-IMS技術很好的進行分離，并通過系統所帶軟件識別不同揮發性物質的差異。

圖2 兩種發酵醬中揮發性成分的二維圖譜Fig.2 Two-dimensional chromatograms of volatile components in two kinds of fermented pastes

2.3.2 香菇柄發酵醬與傳統發酵醬揮發性成分的指紋圖譜對比分析

兩種發酵醬中揮發性成分指紋圖譜見圖3。由圖3可知，有些揮發性物質是共有的，區別僅在于峰體積的大小。主要有乙醇、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、甲基丙醛、丙酮等物質；香菇柄發酵醬中異戊醇、苯乙醛、苯甲醛、己醛、糠醛、乙酸、2-甲基丙酸乙酯2-戊基呋喃等物質的含量較高；傳統發酵醬中芳樟醇、庚醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇、2-甲基-1-丁醇、己醇、異丁醇、戊醛、丁醛、2-甲基丁酸乙酯、乙酸甲酯、3-羥基-2-丁酮、2-丁酮、2,3-丁二酮、己酸、戊酸、2-甲基-3-乙基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,5-二甲基呋喃、二甲基三硫醚等物質的含量較高。

圖3 兩種發酵醬中揮發性風味成分的指紋圖譜Fig.3 Fingerprint of volatile flavor components in two kinds of fermented pastes

根據揮發性成分氣相色譜的保留指數、保留時間和漂移時間，利用GC-IMS Library Search機載插件對所測物質進行定性分析，結果見表3。由表3可知，2種發酵醬共檢測出32中揮發性成分，主要有8類化合物，其中醇類和醛類共17種，是發酵醬中主要的風味物質，其次為酯類和酮類，陳瑤等[21]采用利用氣相-離子遷移色譜分析不同品種魚子醬揮發性成分差異，發現魚子醬中共鑒定出28種揮發性成分，其中醛類16種、酮類5種、醇類3種、烯烴類3種、酯類1種。

表3 兩種發酵醬中揮發性成分的定性分析結果Table 3 Qualitative analysis results of volatile components in two kinds of fermented pastes

續表

醇類化合物主要由支鏈氨基酸、碳水化合物代謝產生，也可由脂肪氧化代謝產生[22]。乙醇在兩種發酵醬中均檢出，并且峰體積較大，說明乙醇含量較高，乙醇具有酒香味，在香菇柄發酵醬中含量較高，峰體積達到了1 977.517。醛類化合物是通過不飽和脂肪酸的降解產生，醛類揮發性成分一般都具有令人愉悅的花果香味、麥芽香味，同時也有較高的閾值[23-24]。醛類揮發性成分中峰體積最豐富的戊醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、2-甲基丙醛，戊醛在傳統發酵醬中峰體積比香菇柄發酵醬高了436.595。酯類化合物產生于發酵過程中醇類物質與酸類物質的酯化反應，主要為乙酯類化合物，二者差異較明顯的酯類化合物為2-甲基丁酸乙酯[25]。共檢測出4種酮類化合物，主要有3-羥基-2-丁酮、2-丁酮、丙酮，2,3-丁二酮含量在4種酮類化合物中峰體積最小。其他類化合物主要是酸類、吡嗪類、呋喃類、醚類化合物，兩種發酵醬中均未檢測出酚類和其他烴類化合物。

2.3.3 香菇柄發酵醬與傳統發酵醬揮發性風味成分主成分分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種重要的降維分析方法之一，利用數據最主要的方面代替原始數據，在食品指紋圖譜研究中應用較為廣泛[26]。利用GC-IMS圖譜數據結合PCA，對不同產地翠冠梨果、不同部位安徽地方火腿、不同烤制過程大鯢肉、不同貯存時間醬香型白酒中的揮發性成分進行了區分研究[27-30]。選擇差異峰對2種發酵醬揮發性風味成分進行PCA分析，結果見圖4。由圖4可知，第一主成分PC1方差貢獻率為94%，第二主成分PC2方差貢獻率為4%，PC1和PC2的累計方差貢獻率為98%，可以很明顯的將香菇柄發酵醬和傳統發酵醬進行很好的區分。由圖4可知，香菇柄發酵醬相對較為集中，而傳統發酵醬相對較為分散，基于2種發酵醬揮發性風味成分可以將兩種醬很好區分開。

圖4 兩種發酵醬中揮發性成分主成分分析結果Fig.4 Principal component analysis results of volatile components in two kinds of fermented pastes

3 結論

通過對2種發酵醬種常規理化指標、氨基酸組成和揮發性成分進行測定，結果表明，香菇柄發酵醬中還原糖含量（21.12%）及紅色指數（1.44）均明顯高于傳統發酵醬，其水分含量（62.79%）及氨基酸態氮含量（0.76%）稍低于傳統發酵醬。兩種發酵醬中均測出17種氨基酸（包含7種必需氨基酸），傳統發酵醬、香菇柄發酵醬氨基酸總量分別為99.09 mg/g、87.71 mg/g，且兩種發酵醬中呈味氨基酸比例相似。兩種發酵醬均共檢測出32種揮發性成分，包括醇類8種、醛類9種、酯類3種、酮類4種、酸類3種、吡嗪類2種、呋喃類2種、醚類1種。香菇柄發酵醬中的必需氨基酸與非必需氨基酸含量比值（EAA/NEAA）高于FAO/WHO模式中對優質蛋白EAA/NEAA的要求（60%）。2種發酵醬中呈味氨基酸含量從高到低依次為鮮味氨基酸＞苦味氨基酸＞甜味氨基酸＞芳香族氨基酸。

利用GC-IMS技術對2種發酵醬中的揮發性成分進行了分析，共鑒定出35種揮發性成分，研究發現2種發酵醬中揮發性成分組成相似，且都是由醇類化合物、醛類化合物在起主要作用。綜上所述，香菇柄參與發酵過程制作香菇柄發酵醬具有理論可行性，在實際生產加工過程中應加大對以香菇柄為原料的深加工食品的開發與利用，可以有效地延長食用菌產業鏈，并創造經濟價值。