響應面法優化超高壓-酶解制備瑪咖酒工藝

殷 欣，韋永倉，彭 濤，張 輝，張小燕

（甘肅省輕工研究院有限責任公司，甘肅 蘭州 730099）

瑪咖（Lepidium meyeniiWalp.）是屬于十字花科的秘魯土著植物，主要生長在海拔高于4 000米的高原地區[1]。瑪咖在20世紀90年代初引入我國，并于2011年獲批為新資源食品[2]。瑪咖傳統上在秘魯被當地人作為一種糧食作物種植，除了作為食品食用外，瑪咖還被視為一種天然的壯陽藥物[3]。除了秘魯當地人食用瑪咖，全世界對瑪咖的需求都在增長，現階段我國云南、西藏等高海拔地區均成功引種瑪咖[4]，甘肅省天祝藏族自治縣也于2017年引種成功。

瑪咖中富含的維生素、礦物質、有機酸等有效成分，其中的瑪咖生物堿能全面調理人體機能，平衡內分泌[5]，具有抗氧化、抗腫瘤[6]及提高動物成熟卵泡小體的數量和精子的質量，從而顯著提高哺乳動物的生育能力[7]。研究表明瑪咖具有調節性激素[8-10]、促進腸胃運動[11]、保肝[12-13]、改善記憶力[14]、抗抑郁[15]、鎮痛[16]等功效，且細胞毒性[17]、急性毒性[18]和長期毒性[19]較低，安全性較高，因此以瑪咖為原料的保健品日益受到人們的矚目。現在市場上大多數產品為瑪咖粗提物或粗粉，這種產品短期服用，人體不易吸收，服用效果不是很理想[20]。目前，對于瑪咖酒的研究主要分為瑪咖浸泡酒和瑪咖發酵酒兩個方向，浸泡酒一般為高度酒[21-22]（酒精度＞40%vol），發酵酒則需外加蔗糖[23]、糯米[24]等作為碳源且酒精度較低（10%vol左右）。

超高壓技術是一種新型的食品加工技術，常用水作為壓力傳遞介質，對在一定溫度下包裝密封于彈性容器中的食品，施加一定壓力（100～1 000 MPa），從而改變食品的功能性質[25]。超高壓能夠最大程度保持食品的原始風味與營養物質，還能夠降低加工能耗，提高能源利用效率，減少環境污染，符合綠色發展理念[26]。超高壓技術在有效成分提取方面具有提取時間短、提取效率高、能耗低的優點[27]。酶具有催化效率高、作用專一的特性，通過應用酶技術可以提高產品深加工程度。果膠酶主要作用是處理破碎果實，加速過濾，促進澄清[28]，纖維素酶可促進植物細胞壁的溶解，使更多的植物細胞內容物溶解出來[29]。超高壓可通過影響酶蛋白的三級結構來影響酶的催化活性，由于蛋白質的三級結構是形成酶活性中心的基礎，超高壓作用導致三級結構崩潰時，使酶活性中心的氨基酸組成發生改變或喪失活性中心，從而改變其酶的催化活性，而在較低壓力下酶的活性開始上升則被認為是壓力產生了酶活性中心的凝聚作用[30]。其次，在完整組織中的酶和基質經常被隔離，而較低的壓力反而可以破壞這種隔離狀態，使酶與基質相互接觸，從而加速酶促反應活性[31]，因此，在超高壓處理酶時就要注意壓力和溫度的結合。

瑪咖纖維素含量高、韌度大[32]，為有效提取瑪咖中的活性成分生物堿，本研究以瑪咖為原料，采用超高壓-酶解技術制備瑪咖酒，以總生物堿提取率和感官評分為評價指標，采用單因素試驗及響應面試驗優化瑪咖酒的制備工藝條件，旨在充分發揮甘肅瑪咖資源優勢，提高其經濟附加值，為瑪咖酒的產業化開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瑪咖（充分成熟，自然干燥，大小適中、結構緊密、頸部細小，有瑪咖天然的辛辣味，外皮黃色，內部為一致的白色或淡黃色）：甘肅天祝藏族自治縣、體積分數95%乙醇（分析純）、果膠酶（50萬U/g）、纖維素酶（50萬U/g）：江蘇銳陽生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

ZN-1000高速中藥粉碎機：中南制藥機械廠；超高壓生物反應器：凱蘭德科技實業有限公司；HH-4電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器公司；AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UH5300雙光束紫外可見光分光光度計：日立高新技術公司。

1.3 方法

1.3.1 瑪咖酒的制備工藝流程及操作要點

瑪咖塊根→粉碎→加酶、活化→常壓酶解或超高壓-酶解→加體積分數95%乙醇浸泡→過濾→包裝→瑪咖酒

操作要點：

將瑪咖塊根粉碎，過100目篩，稱取瑪咖粉末20 g，以料液比1∶30（g∶mL）加水，加果膠酶（添加量0.5‰）、纖維素酶（添加量0.2‰），60 ℃水浴活化30 min后，以常壓酶解（酶解溫度55 ℃、酶解pH 5、酶解時間2 h）為對照，進行超高壓-酶解處理（壓力90 MPa、酶解溫度55 ℃、酶解pH 5、酶解時間2 h），酶解后放入棕色細口瓶中，加入體積分數95%乙醇的酒精調整酒精度至55%vol浸泡15 d后過濾，加蓋密封即得瑪咖酒成品，并避光貯存。

1.3.2 瑪咖酒的超高壓-酶解制備工藝優化

單因素試驗：以料液比1∶30（g∶mL）加水，設定酶解溫度為45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃，酶解壓力為90 MPa、100 MPa、110 MPa、120 MPa和常壓，乙醇體積分數為45%、50%、55%、60%、65%進行單因素試驗，考察各因素對瑪咖酒總生物堿提取率和感官評分的影響。

響應面試驗：根據單因素試驗結果，選出對瑪咖酒感官指標影響較大的3個因素酶解壓力（A）、乙醇體積分數（B）、酶解溫度（C）為自變量，以瑪咖酒綜合評價值（Y）為響應值，并根據中心復合試驗設計原理，進行3因素3水平的響應面試驗，其因素及水平見表1。

表1 制備工藝優化響應面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for preparation process optimization

1.3.3 分析檢測

（1）生物堿的測定

生物堿的測定采用分光光度法。

鹽酸小檗堿標準曲線制作：參考文獻[33-34]的方法，以鹽酸小檗堿對照品濃度為橫坐標（X），以吸光度值為縱坐標（Y），繪制鹽酸小檗堿標準曲線，獲得鹽酸小檗堿的標準曲線回歸方程為Y=20.765X+0.035，相關系數R2為0.998 1。

瑪咖粉中生物堿測定[35]：瑪咖粉甲醇浸提3次，合并提取液并濃縮為浸膏，2%HCl洗滌3次，合并酸液，5 000 r/min離心10 min，上清液用質量分數10%的NaOH調節pH至10，再用等體積氯仿萃取3次，合并萃取液后濃縮定容至10 mL，按標準曲線處理方法于波長414 nm處測吸光度值，代入鹽酸小檗堿標準曲線回歸方程計算瑪咖粉中生物堿含量。

瑪咖酒中生物堿測定[36]：瑪咖酒10.0 mL，注入烘干的瓷蒸發皿內，置于沸水浴上蒸發至浸膏，2%HCl洗滌溶解3次，合并酸液，10 000 r/min 離心15 min。取酸溶液，用質量分數10%NaOH溶液調至pH 10，再用等體積氯仿萃取3次，合并萃取液并定容至10 mL，按標準曲線處理方法于波長414 nm處測定吸光度值，代入標準曲線回歸方程計算瑪咖酒中總生物堿的含量。

（2）生物堿提取率計算

生物堿的提取率計算公式如下：

式中：P為總生物堿提取率，%；C為提取液中生物堿質量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；M為瑪咖粉中生物堿含量，mg。

（3）綜合評價值計算

綜合評價值=總生物堿提取率得分×40%+感官評分×60%

總生物堿提取率得分以提取率達到70%為100分，其他按比例計算。

1.3.4 感官鑒評方法

參考曲云龍[37]的白酒感官評定方法，由8名專業人員組成感官評價小組，以外觀、香氣、色澤、滋味為評價指標，對樣品進行評分，總分100分，瑪咖酒感官評分標準見表2。

表2 瑪咖酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of Maca wine

1.3.5 數據處理

本實驗采用Design-Expert 8.0.6軟件分析處理數據，采用Excel2019軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 瑪咖酒的超高壓-酶解制備工藝優化單因素試驗

2.1.1 酶解溫度對瑪咖酒品質的影響

在常見的纖維素酶產生菌中，如曲霉、青霉及木霉，產生的酶一般為酸性酶，酶的最適溫度大多在45～65 ℃之間。酶解溫度對瑪咖酒總生物堿提取率及感官指標的影響見圖1。

圖1 酶解溫度對瑪咖酒總生物堿提取率及感官評分的影響Fig.1 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on extraction rate of total alkaloids and sensory scores of Maca wine

由圖1可知，隨著酶解溫度在45～60 ℃范圍內的升高，總生物堿提取率和感官評分均逐漸增加，當酶解溫度為60 ℃時，總生物堿提取率、感官評分最高，分別為42.67%、88分，當酶解溫度高于60 ℃，總生物堿提取率和感官評分下降。故確定最適酶解溫度為60 ℃。

2.1.2 酶解壓力對瑪咖酒品質的影響

酶解壓力對瑪咖酒感官指標及總生物堿提取率的影響見圖2。

由圖2可知，隨著酶解壓力在90～110 MPa范圍內的升高，總生物堿提取率與感官評分均逐漸增加，當酶解壓力為110 MPa時，瑪咖酒感官評分和總生物堿提取率均達到最高值，分別為93分、67%，當酶解壓力＞110 MPa，感官評分及總生物堿提取率均下降而常壓下酶解的瑪咖酒總生物堿提取率遠低于超高壓酶解，故確定最適酶解壓力為110 MPa。

圖2 酶解壓力對瑪咖酒總生物堿提取率及感官評分的影響Fig.2 Effects of enzymatic hydrolysis pressure on total alkaloid extraction rate and sensory scores of Maca wine

2.1.3 乙醇體積分數對瑪咖酒品質的影響

由圖3可知，乙醇體積分數對總生物堿提取率影響不大，當乙醇體積分數為60%時，總生物堿提取率達到最大值，為34%；當乙醇體積分數在45%～60%時，瑪咖酒感官評分逐漸增加，當乙醇體積分數為60%時，感官評分達到最大值，為90分，當乙醇體積分數＞60%，感官評分下降。故確定最適乙醇體積分數為60%。

圖3 乙醇體積分數對瑪咖酒總生物堿提取率及感官評分的影響Fig.3 Effects of ethanol volume fraction on total alkaloid extraction rate and sensory scores of Maca wine

2.2 瑪咖酒超高壓酶解制備工藝優化響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗結果及方差分析

根據單因素試驗結果，選出對瑪咖酒感官指標影響較大的3個因素為自變量，即酶解壓力（A），乙醇體積分數（B）及酶解溫度（C），以瑪咖酒綜合評價值為響應值（Y），并根據中心復合試驗設計原理，進行3因素3水平的響應面試驗，響應面試驗結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 制備工藝優化響應面試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of response surface experiments for preparation process optimization

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

試驗結果采用Design-Expert 8.0.6軟件ANOVA程序，進行二次回歸分析，得到瑪咖酒綜合評價值的變化對酶解壓力、乙醇體積分數以及酶解溫度的二次回歸方程為：

由表3可知，回歸模型P值＜0.000 1，說明所得回歸方程極顯著，失擬項P=0.170 2＞0.05，不顯著，說明此回歸模型擬合度良好，可信度較高。模型決定系數R2=0.999 0，調整決定系數R2adj=0.997 8，說明該模型擬合程度較好，由P值可知，一次項A、B、C，交互項AB對結果影響極顯著（P＜0.01），其他因素對結果影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，影響綜合評價值的各因素順序為乙醇體積分數（B）＞酶解壓力（A）＞酶解溫度（C）。

2.2.2 各因素交互作用響應面分析

由圖4可知，當酶解壓力、乙醇體積分數、酶解溫度兩兩交互作用時，對瑪咖酒綜合評價值有影響，其中，A、B互交作用響應曲面較為陡峭，等高線橢圓程度較為明顯，表明A與B之間具有良好的交互作用，對綜合評價值影響顯著（P＜0.05）。這與方差分析結果一致。

圖4 各因素交互作用對瑪咖酒綜合評價值影響的響應曲面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on comprehensive evaluation value of Maca wine

2.2.3 酶解制備工藝優化驗證試驗

由Design-Expert 8.0.6軟件對上述試驗結果進行優化分析，獲得瑪咖酒最佳超高壓-酶解制備工藝條件為：酶解壓力110.02 MPa，乙醇體積分數59.89%，酶解溫度60.01 ℃，在該條件下，綜合評價預測值為96.04分。考慮到實際操作，將制備工藝條件修正為：酶解壓力110 MPa，乙醇體積分數60%，酶解溫度60 ℃，在此優化條件下，進行3次平行驗證試驗，得到瑪咖酒綜合評價實際值為96.1，與預測值接近。其中總生物堿提取率為67.28%，感官評分為96.06分。

3 結論

本研究選用甘肅瑪咖為原料，采用超高壓酶解技術制備瑪咖酒。瑪咖酒最佳超高壓-酶解制備工藝條件為：酶解壓力110 MPa，酶解溫度60 ℃，乙醇體積分數60%，在該優化條件下，瑪咖酒總生物堿提取率為67.28%，感官評分為96.06分，呈金黃色，具有瑪咖的天然野草根氣味，有瑪咖的特殊辛辣味，酒質澄清，無雜質。且產品設計、生產及檢驗標準均符合國標GB 2757—2012《蒸餾酒及其配制酒》的要求。該研究充分利用甘肅新興資源瑪咖加工瑪咖酒，采用該工藝縮短了瑪咖酒生產工藝環節，提高了原料利用率，優化了瑪咖酒的生產工藝，提高了產品中有效成分含量，節約了生產成本，開創了新的加工手段，為甘肅省開發利用瑪咖資源提供了新的方向。