新型黃酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

黃 河，黃 婷，王 媚，李 征，趙金松，，3*

（1.四川省酒業(yè)集團科技開發(fā)有限公司，四川 成都 610199；2.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 643002；3.四川省酒業(yè)集團有限責任公司，四川 瀘州 611230）

黃酒起源于中國，享有“酒中之祖”、“酒中之王”、“中國酒中的瑰寶”美譽[1-2]，與葡萄酒、啤酒被稱為世界上三大古酒[3-4]。黃酒的特色是“以麥制曲，以曲釀酒”[5]，麥曲在黃酒釀造過程中至關(guān)重要，可作為黃酒釀造的糖化劑、發(fā)酵劑和生香劑，被稱為“酒之骨”[6-7]，黃酒的高濃液態(tài)發(fā)酵技術(shù)、雙邊并行復式發(fā)酵技術(shù)均經(jīng)過多種微生物共同發(fā)酵的過程，特定的發(fā)酵工藝使黃酒具有獨特的風味特征以及特定的功能性[8]。因此，黃酒酒體醇和、酒香突出[9]，營養(yǎng)豐富[10]，且富含豐富的功能因子[11]，如活性多糖、功能性低聚糖、黃酮類、酚類、萜烯類、三羥甲基丙烷、γ-氨基丁酸、谷胱甘肽等，具有抗氧化、提高機體免疫力、預防心血管疾病等多種生理功能[12-16]，深受消費者喜愛。但近年來，黃酒發(fā)展速度一直比較緩慢，因此，為黃酒行業(yè)的發(fā)展尋找新的突破口迫在眉睫。在傳統(tǒng)黃酒釀造的基礎(chǔ)上，開發(fā)新型黃酒是一種有效方式。目前，對于新型黃酒的定義尚不明確，主要指的是通過工藝創(chuàng)新制得的黃酒，其酒質(zhì)、風味與傳統(tǒng)黃酒有所區(qū)別，符合消費者需求以及新飲酒觀[17]。

日本清酒的釀造工藝受中國“曲糵釀酒”的影響。在清酒釀造中，發(fā)揮主要作用的是屬于釀酒酵母類的清酒酵母。日本清酒酵母具有發(fā)酵性能好、代謝產(chǎn)物富含果香、發(fā)酵酒體口感清爽、在發(fā)酵過程中不會形成高泡、罐利用系數(shù)較高等優(yōu)點[18]。日本清酒和中國黃酒是同一類型的低度釀造米酒，兩者的功能因子和保健功能相似，但風格上有很大的差異。日本清酒品種繁多，清澈透明，色澤淡黃或無色，酸度小，酒度低，口味棉柔爽口，酸甜苦辣澀味協(xié)調(diào)，適飲性高，是日本國內(nèi)餐桌常見的飲料，并遠銷國外[19]。市場影響力不及清酒，日本清酒在中國市場占有率不斷增加。中國黃酒與日本清酒的釀造工藝相仿，故清酒的先進生產(chǎn)技術(shù)對我國黃酒有一定的借鑒意義。因此，開發(fā)一種具有清酒特色的新型黃酒，豐富中國酒類飲料市場已迫在眉睫[20]。目前，還沒有關(guān)于采用日本清酒酵母釀造黃酒的研究報道。

該研究采用日本清酒酵母，結(jié)合日本清酒的三段投料方法，利用傳統(tǒng)黃酒高濃液態(tài)發(fā)酵特點制備新型黃酒。以總加權(quán)評分值為評價指標，通過單因素試驗與響應面試驗優(yōu)化新型黃酒的發(fā)酵工藝條件，并對新型黃酒的品質(zhì)進行評價。以期開發(fā)獨具特色、受眾廣泛的新型黃酒，為滿足黃酒的多元化及市場化的發(fā)展需求提供基礎(chǔ)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

粳米、小麥：采購自沃爾瑪超市；米曲霉（Aspergillus oryzae）Su-16和AOK139、日本清酒酵母（Iaponica propter fermentum）ACCC20045：西南工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

乳酸（食品級）：成都科龍化工有限公司；甲醛溶液（36%～38%）、亞鐵氰化鉀：成都市科龍化工試劑廠；氫氧化鈉：成都金山化學試劑有限公司；無水葡萄糖、無水乙醇：成都市科隆化學品有限公司；重鉻酸鉀：重慶川東化工（集團）有限公司化學試劑廠；酒石酸鉀鈉：西隴化工股份有限公司。所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Phs-25酸度計：成都世紀方舟科技有限公司；CP213電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；BT457電子天平：深圳市博途電子科技有限公司；101-3SB電熱恒溫干燥箱：紹興市蘇珀儀器有限公司；HH-S恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市正基儀器有限公司；UV1000紫外可見分光光度計：北京萊伯泰科科技有限公司；TM05C實驗用碾米機：佐竹機械（蘇州）有限公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱：泰宏醫(yī)療器械有限公司；0.45 μm不銹鋼正壓桶式過濾器：上海羽令過濾器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 新型黃酒生產(chǎn)工藝流程及操作要點

（1）生產(chǎn)工藝流程[18，21]

（2）操作要點[21-22]：

粳米預處理：選取粳米，采用實驗用碾米機將其打磨至精米率80%后浸泡24～36 h，洗滌濾干。

蒸飯：稱100 g浸泡后的粳米至250 mL三角瓶，密封、圓汽后，于高壓滅菌鍋內(nèi)110 ℃蒸45 min。冷卻，移至1 000 mL燒杯中。

米麥曲的制備：選取原料總質(zhì)量70%的粳米，按上述方法進行預處理、蒸飯后獲得熟米飯，與30%的小麥混合后，接種Su-16和AOK139孢子（原料量的0.5%），獲得米麥曲。

糖化：在熟米飯中加入稱量好的米麥曲（原料粳米用量的12%～14%）、適量蒸餾水（米和水的比例在1∶2以上），混合均勻，密封，于56 ℃糖化5 h；加入水分與大米總質(zhì)量7‰的乳酸，繼續(xù)于56 ℃糖化1 h，急速冷卻到室溫。

發(fā)酵：于上述物料中加入0.1%原料的日本清酒酵母，于30 ℃發(fā)酵1 d。大米原料基本上已被利用發(fā)酵，獲得人工酵母培養(yǎng)液（酒母）。

糖化、發(fā)酵：按照上述方法蒸飯，分三次加入原料粳米、米麥曲、蒸餾水（請分別補充這三者比例）。第一次投料用量為制作酒母原料用量的2倍，18 ℃糖化發(fā)酵2 d；第二次投料用量為第一次投料用量的2倍，12 ℃糖化發(fā)酵1 d；第三次投料用量為第二次投料用量的2倍，主發(fā)酵溫度（15 ℃）糖化發(fā)酵20 d。三段投料且喂飯量逐步增大，有利于擴大投料量，促進醪液翻耙，產(chǎn)酒量最大。

壓濾：無紡布精密細沙濾網(wǎng)食用絹布袋，手動壓濾。

沉降、過濾：4 ℃條件下沉降1晝夜，然后取上清液，0.45 μm不銹鋼正壓桶式過濾器過濾。

煎酒：于85 ℃加熱25 min，100 ℃水浴滅菌30 min。

陳釀：分別于4 ℃和25～33 ℃溫度下間隔10 d交替陳釀，共計2個月，即得新型黃酒。

1.3.2 新型黃酒發(fā)酵工藝優(yōu)化

單因素試驗：以米麥曲添加量（10%、20%、30%、40%、50%）；日本清酒酵母添加量（1%、2%、3%、4%、5%）；主發(fā)酵溫度（12 ℃、13 ℃、14 ℃、15 ℃、16 ℃）；料水比（原料粳米與水的質(zhì)量比）（1.0∶0.8、1.0∶1.0、1.0∶1.2、1.0∶1.4、1.0∶1.6（g∶mL））為影響因素進行單因素試驗，以感官評分、酒精度、非糖固形物含量及氨基酸態(tài)氮含量為評價指標，考察各因素對新型黃酒品質(zhì)的影響。

響應面試驗：固定日本清酒酵母添加量為3%，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken試驗設(shè)計對米麥曲添加量（A）、主發(fā)酵溫度（B）、料水比（C）三個主要影響因素進行優(yōu)化，以總加權(quán)評分（總加權(quán)評分值的構(gòu)成為：感官評分30%、氨基酸態(tài)氮含量30%、酒精度20%、非糖固形物含量20%）為響應值（Y），采用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計3因素3水平的響應面試驗，因素及水平見表1。

表1 新型黃酒發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-behnken experiments for fermentation process optimization of new-type Huangjiu

1.3.3 分析檢測

pH值的測定：參照GB/T 13662—2018《黃酒》[23]中的6.4電位滴定法；氨基酸態(tài)氮含量的測定：參照GB/T 13662—2018《黃酒》[23]中的6.5電位滴定法；總糖含量的測定：參照GB/T 13662—2018《黃酒》[23]中的6.2.2亞鐵氰化鉀滴定法（仲裁法）；非糖固形物含量的測定：參照GB/T 13662—2018《黃酒》[23]中6.3.1重量法（仲裁法）；酒精度的測定：重鉻酸鉀氧化比色法[24]。

1.3.4 感官評價

按照GB/T 13662—2018《黃酒》[25]中傳統(tǒng)型半干黃酒感官評價方法，結(jié)合日本清酒感官評價標準[20]，制定的新型黃酒的感官評價標準見表2，滿分為100分，選7名酒類品評專業(yè)人員，通過感官品評對新型黃酒的各項進行評分，結(jié)果取平均值。

表2 新型黃酒感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of new-type Huangjiu

1.3.5 統(tǒng)計分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原則進行響應面試驗，并利用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對試驗結(jié)果進行多重比較。采用Origin 2021軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 新型黃酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗結(jié)果

2.1.1 米麥曲添加量的確定

米麥曲添加量對新型黃酒感官評分和理化指標的影響見圖1。

圖1 米麥曲添加量對新型黃酒感官評分和理化指標的影響Fig.1 Effects of Mimaiqu addition on sensory scores and physicochemical indexes of new-type Huangjiu

由圖1可知，隨著米麥曲添加量在10%～50%范圍內(nèi)的增加，新型黃酒中氨基酸態(tài)氮含量逐漸上升；在米麥曲添加量50%時，氨基酸態(tài)氮含量達到最大值，為0.70 g/L。而非糖固形物含量呈下降趨勢，當米麥曲添加量為10%時，新型黃酒非糖固形物含量最高，為27.2 g/L。當米麥曲添加量在10%～30%之間時，酒精度逐漸增加；米麥曲添加量為30%時，酒精度達到最高，為15.5%vol；米麥曲添加量＞30%，酒精度有所下降，但米麥曲添加量在20%～30%范圍內(nèi)時，酒精度變化不顯著（P＞0.05）。隨著米麥曲添加量在10%～20%范圍內(nèi)的增加，新型黃酒感官評分逐漸上升；在米麥曲添加量為20%時，感官評分達到最高值，為95分；隨著米麥曲霉添加量繼續(xù)增加，感官評分逐漸下降。綜合考慮，選擇最佳米麥曲添加量為20%。

2.1.2 酵母添加量的確定

酵母添加量對新型黃酒感官評分和理化指標的影響見圖2。

圖2 酵母添加量對新型黃酒感官評分和理化指標的影響Fig.2 Effect of yeast addition on sensory scores and physicochemical indexes of new-type Huangjiu

由圖2可知，隨著酵母添加量在1%～5%范圍內(nèi)的增加，新型黃酒的氨基酸態(tài)氮含量呈緩慢增加的趨勢，但氨基酸態(tài)氮含量差異不顯著（P＞0.05）。酵母添加量＜4%時，非糖固形物含量緩慢上升；當酵母添加量為4%時，非糖固形物含量達到最高值，為27.2 g/L；酵母添加量＞4%時，非糖固形物含量有所下降，但差異不顯著（P＞0.05）；酵母添加量在1%～3%范圍內(nèi)時，酒精度緩慢上升；當酵母添加量為3%時，酒精度達到15.0%vol，酵母添加量＞3%，酒精度值有所下降，但差異不顯著（P＞0.05）。酵母添加量1%～3%范圍內(nèi)，感官評分逐漸增加；當酵母添加量為3%時，感官評分達到最高值，為80分；酵母添加量＞3%，感官評分下降（P＞0.05）。綜合考慮，選擇最佳酵母添加量為3%。

2.1.3 主發(fā)酵溫度的確定

溫度是影響酶活性的主要因素，溫度偏低，酶的活性受到抑制，發(fā)酵不充分，酒精度會偏低[25]。主發(fā)酵溫度對新型黃酒感官評分和理化指標的影響見圖3。

圖3 主發(fā)酵溫度對新型黃酒感官評分和理化指標的影響Fig.3 Effect of main fermentation temperature on sensory scores and physicochemical indexes of new-type Huangjiu

由圖3可知，隨著主發(fā)酵溫度在12～16 ℃范圍內(nèi)的增加，氨基酸態(tài)氮含量緩慢增加，當主發(fā)酵溫度為16 ℃時，氨基酸態(tài)氮含量達到最大值，為0.56 g/L。主發(fā)酵溫度在12～15 ℃范圍內(nèi)時，非糖固形物含量逐漸增加；主發(fā)酵溫度為15 ℃時，達到最高值，為26.3 g/L；主發(fā)酵溫度高于15 ℃，非糖固形物含量開始下降。隨著主發(fā)酵溫度升高，新型黃酒的酒精度緩慢上升，當主發(fā)酵溫度為16 ℃時，酒精度值為15.2%vol，但變化不顯著（P＞0.05）。主發(fā)酵溫度在12～14 ℃范圍內(nèi)時，感官評分逐漸增加；主發(fā)酵溫度為14 ℃時，感官評分最高，為85分，主發(fā)酵溫度高于14 ℃后，感官評分下降。綜合考慮，選擇最佳主發(fā)酵溫度為15 ℃。

2.1.4 料水比的確定

料水比對新型黃酒感官評分和理化指標的影響見圖4。

由圖4可知，隨著液體占比的增加，新型黃酒中的氨基酸態(tài)氮含量逐漸減少，料水比為1∶0.8（g∶mL）時，氨基酸態(tài)氮含量為0.61 g/L。料水比在1∶1.0～1∶1.2范圍內(nèi)時，非糖固形物含量增加；當料水比為1∶1.2時，非糖固形物含量達到最高值，為25.8 g/L；料水比超過1∶1.2之后，非糖固形物含量迅速下降。當料水比在1∶0.8～1∶1.0范圍內(nèi)，酒精度增加；當料水比為1∶1.0時，酒精度達到最高值，為16.1%vol；料水比在1∶1.0～1∶1.6范圍內(nèi)時，酒精度下降，其原因可能是加水量過少時，發(fā)酵液被稀釋，影響發(fā)酵速度[26]。當料水比在1∶0.8～1∶1.4范圍內(nèi)，感官評分逐漸增加；料水比為1∶1.2和1∶1.4時，感官評分最高，均為80分；料水比為1∶1.6時，感官評分下降。綜合考慮，選擇最佳料水比為1∶1.4（g∶mL）。

圖4 料水比對新型黃酒感官評分和理化指標的影響Fig.4 Effect of solid and liquid ratio on sensory scores and physicochemical indexes of new-type Huangjiu

2.2 新型黃酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 響應面試驗設(shè)計及結(jié)果

固定日本清酒酵母的添加量為3%。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定米麥曲添加量（A）、主發(fā)酵溫度（B）、料水比（C）為考察因素，以總加權(quán)評分值作為響應值（Y），利用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計3因素3水平響應面試驗，響應面試驗結(jié)果見表3，方差分析見表4。根據(jù)表3結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到二次回歸方程：

表3 新型黃酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface tests for fermentation process optimization of new-type Huangjiu

由表4可知，該模型P=0.000 6＜0.01，表明該模型極顯著，失擬項P=0.088 1＞0.05，說明失擬程度不顯著，即該試驗數(shù)據(jù)與模型擬合良好，該回歸方程可用。模型決定系數(shù)R2=0.955 6，表明該回歸模型有著很好的擬合效果。模型調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.898 5，說明此模型可以解釋89.85%響應值變化。模型決定系數(shù)和調(diào)整系數(shù)比較接近，說明該模型的預測性良好，試驗誤差小。決定變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為6.49%，說明試驗數(shù)據(jù)離散程度可以接受。該模型可用于預測新型黃酒的總加權(quán)評分值。回歸方程的方差分析結(jié)果表明，二次項A2、B2、C2對響應值影響極顯著（P＜0.01），一次項A、B、C和交互項AB對響應值的影響顯著（P＜0.05）。交互項AC、BC對響應值影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，影響總加權(quán)評分值的因素大小排序為C＞B＞A，即料水比＞主發(fā)酵溫度＞米麥曲添加量。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variances analysis of regression model

2.2.2 響應面交互作用分析

響應曲面圖坡度變化越陡，等高線密集且成橢圓形，則表示兩因素交互作用顯著。根據(jù)響應曲面及其等高線圖可評價影響因素之間的相互作用及其對總加權(quán)評分的影響，以確定各因素的最佳水平范圍。各因素交互作用對總加權(quán)評分值影響的響應曲面和等高線見圖5。

圖5 各因素間交互作用對新型黃酒總加權(quán)評分值影響的響應曲面及等高線Fig.5 Response surface plots and counter lines of effects of interactions between various factors on total weighted score value of new-type Huangjiu

由圖5可知，由圖5a可知，因素A與因素B所形成的響應曲面坡度陡峭，表明米麥曲添加量與主發(fā)酵溫度之間的交互作用較強，影響顯著（P＜0.05）；由圖5b可知，因素A與因素C所形成的響應曲面坡度較平緩，表明料水比與米麥曲添加量之間有交互作用，但交互作用不顯著（P＞0.05）；由圖5c可知，因素B與因素C所形成的響應曲面坡度平緩，表明主發(fā)酵溫度與料水比之間的交互作用不強，差異不顯著（P＞0.05），這與表5方差分析的結(jié)果一致。

2.2.3 驗證試驗

對Design Expert 8.0.6得出的擬合函數(shù)求解，得到新型黃酒釀造的最佳工藝條件為：米麥曲添加量20.42%，主發(fā)酵溫度14.54 ℃，料水比1∶1.36（g∶mL），此條件下新型黃酒總加權(quán)評分理論值為84.28分。為了驗證響應面試驗優(yōu)化的結(jié)果，且考慮到實際操作的方便可行性，將新型黃酒發(fā)酵工藝條件修正為：米麥曲添加量20%，主發(fā)酵溫度15 ℃，料水比1.0∶1.4（g∶mL）。在此條件下進行5次平行試驗，去除兩組偏差較大的數(shù)據(jù)后，得到總加權(quán)評分平均實際值為84.0分。試驗結(jié)果表明，此發(fā)酵工藝的實測值與理論值相近，具有一定的實際應用價值。采用該工藝條件制備的新型黃酒氨基酸態(tài)氮含量為0.40 g/L、非糖固形物含量為25.28 g/L、酒精度為15.18%vol、pH值為4.21。酒體呈淡黃色，清亮透明，有光澤，無沉淀物和雜質(zhì)；具有黃酒特有的醇香，有純正、優(yōu)雅、和諧的香氣；口味鮮美爽口、醇厚柔和，無異味；同時具有典型的清酒和黃酒的風格，酒體協(xié)調(diào)柔和；酒精度下降，減淡了消費者飲用時的殺口感，酒品更清爽，更適合大眾口味。

2.3 新型黃酒品質(zhì)分析

黃酒質(zhì)量控制和決定風味的主要指標是酒精度、總糖和氨基酸態(tài)氮[27]。當前，將風味物質(zhì)的化學分析與感官評價相結(jié)合，尤其是滋味物質(zhì)與黃酒感官特性的相關(guān)性研究鮮見報道[28]。在半干型黃酒（一級）[23]基礎(chǔ)上，考慮酒體口感，防止過甜或過酸（澀）。同時，從維護自然釀造黃酒的角度出發(fā)，新型黃酒進行品質(zhì)分析，結(jié)果見表5。

表5 新型黃酒品質(zhì)分析Table 5 Quality analysis results of new-type Huangjiu

由表5可知，新型黃酒的酒精度、pH值、非糖固形物含量和氨基酸態(tài)氮含量等質(zhì)量指標均滿足GB/T 13662—2018《黃酒》中半干型黃酒（一級）標準。

3 結(jié)論

通過單因素試驗及響應面試驗優(yōu)化新型黃酒釀造工藝條件。結(jié)果表明，新型黃酒的最佳發(fā)酵工藝條件為：日本清酒酵母添加量3%、米麥曲添加量20%、主發(fā)酵溫度15 ℃、料水比1∶1.4（g∶mL）。在此優(yōu)化條件下，新型黃酒的總加權(quán)評分平均值為84.0分，氨基酸態(tài)氮含量為0.40 g/L、非糖固形物含量為25.28 g/L、酒精度為15.18%vol、pH值為4.21。酒體呈淡黃色，清亮透明，有光澤，具有黃酒特有的醇香，口味鮮美爽口酒體協(xié)調(diào)柔和，酒精度下降，減淡了消費者飲用時的殺口感，更適合大眾口味。