酸性蛋白酶對高鹽稀態醬油發酵的影響

余潔瑜，林禮釗，李維新，何嘉慧

（鶴山市東古調味食品有限公司，廣東 江門 529738）

醬油是中國傳統的調味品之一，根據釀造工藝可分為低鹽固態醬油與高鹽稀態醬油。其中高鹽稀態醬油發酵包括固態制曲和鹽水發酵兩個階段。以大豆/豆粕、小麥/麩皮為原料，接入米曲霉進行固態制曲，米曲霉分泌積累大量蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、葡萄糖苷酶等酶系，對曲料中的生物大分子物質進行初步水解[1-2]。然后向成曲中加入2.0～2.5倍的鹽水（18%～20%），進入鹽水發酵階段[3]。在高鹽環境中霉菌的生長基本停止，耐鹽乳酸菌和耐鹽酵母等微生物逐漸占主導地位，促進醬油中醇、醛、酸、酯、酚等更多風味物質的形成[4-5]。

蛋白酶在鹽水溶液中不穩定，在18%NaCl溶液中殘留的蛋白酶活性僅為3%[6]，導致蛋白質原料在鹽水發酵階段無法被進一步有效利用，造成原料浪費。在醬油鹽水發酵階段添加酸性蛋白酶，可以彌補醬醪中酸性蛋白酶活力較低的不足。目前已有研究表明，在以蛋白質為基質的食品發酵過程中添加酸性蛋白酶，能夠提高蛋白質利用率，縮短發酵周期，提高產品的氨基酸態氮含量[7-9]。

醬油發酵是一個非常復雜的過程，發酵過程中微生物、酶、代謝產物之間相互影響[1，10-12]，改變發酵條件或額外添加物質對醬油發酵的影響是牽一發而動全身的。有研究指出[13]，在醬醪中額外添加酵母菌或糖化液，會影響醬醪的菌群結構及有機酸、氨基酸、揮發性風味物質等代謝產物。酸性蛋白酶的加入也有可能改變發酵體系的菌群結構、影響產品風味[14-15]。目前關于酸性蛋白酶在醬油方面的研究主要集中在菌種選育和混合制曲兩個方面。SHU L等[16]采用大氣和室溫等離子體系統對米曲霉（Aspergillus oryzae）3.042菌株進行誘變得到突變菌株B-2，其酸性蛋白酶活力增加54.7%。呂遠平等[17]的研究表明，采用高活力酸性蛋白酶菌種與米曲霉混合制曲，能夠提高醬油曲的酸性蛋白酶活力，有效提高全氮利用率和氨基酸生成率。徐德峰[18]采用電場誘導原生質體融合技術篩選獲得一株酸性蛋白酶活力較親本米曲霉（A.oryzae）HN3042提高82.19%的融合子并將其初步應用于醬油發酵，與親本米曲霉制備醬油發酵液相比，新菌株制備醬油發酵液中的總酸、總氮和氨基酸態氮含量均有所提高，醬油發酵液的風味也有所改善。但目前對于在高鹽稀態醬油發酵過程中添加酸性蛋白酶制劑的研究鮮有報道。

本研究以高鹽稀態發酵醬油為研究對象，在醬油發酵初期（0 d）添加酸性蛋白酶（1‰），通過分析發酵過程中醬醪的酸性和中性蛋白酶活力、pH、總酸含量、氨基酸態氨含量和游離氨基酸含量的變化，以及生醬油中呈味氨基酸含量，考察添加外源酸性蛋白酶對醬油發酵的影響，以期為外源酸性蛋白酶在工業化釀造醬油生產中的應用提供一定的參考依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬油成曲（曲料無塊狀、呈淡黃色并帶淺綠色，具有成曲固有氣味，無異味；水分＜30%）：鶴山市東古調味食品有限公司；酸性蛋白酶（酶活50 000 U/g）：山東和眾康源生物科技有限公司。

福林酚（分析純）：福州飛凈生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；三氯乙酸、乳酸、乳酸鈉（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠；酪氨酸、干酪素（均為分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；氨基酸標準品（純度均＞98%，天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸濃度均為2 500 pmol/μL，胱氨酸濃度為1 250 pmol/μL）：美國Sigma公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：北京迪馬科技有限公司；鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）、9-芴甲基氯甲酸酯（9-fluorenylmethyl chloroformate，FOMC）（分析純）：安捷倫科技貿易（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀（配熒光檢測器）：美國安捷倫Agilent科技有限公司；905自動電位滴定儀：瑞士萬通（中國）有限公司；TU-1901紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；HH-W420數顯三用恒溫水箱：常州普天儀器制造有限公司；MS105DU/A半微量天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高鹽稀態醬油的制備工藝流程及操作要點

酸性蛋白酶、鹽水→成曲→天然曬制→生醬油

操作要點：

黃豆：鹽水的比例按照1.0∶2.6（g∶g）添加鹽水（19.4%），以黃豆質量的1‰添加酸性蛋白酶。曲料攪拌均勻后進行天然曬制（當地溫度為25～35 ℃）發酵，發酵2個月[19-20]后收取生醬油。

1.3.2 樣品的制備

樣品取自天然曬制工藝過程，分別收取發酵1 d、2 d、4 d、6 d、10 d、20 d、30 d、40 d、50 d、62 d醬油醪液樣品，用快速濾紙過濾，將濾液用于分析檢測。

1.3.3 分析檢測

中性蛋白酶、酸性蛋白酶活的測定：采用福林法[21]。中性蛋白酶的酶活定義：1 mL濾液在pH 7.5、40 ℃下，每分鐘水解酪蛋白中釋放1 μg酪氨酸的能力為1個活力單位（U/mL）；酸性蛋白酶的酶活定義：1 mL濾液在pH 3.0、40 ℃下，每分鐘水解酪蛋白中釋放1 μg酪氨酸的能力為1個活力單位（U/mL）。

pH的測定：采用pH計；總酸含量的測定：采用酸度計法[22]；氨基酸態氮含量的測定：采用甲醛法[22]。

游離氨基酸含量的測定：采用柱前衍生-高效液相色譜法，操作如下：

樣品前處理：參考馬艷莉等[23]的方法。吸取1 mL樣品濾液于50 mL的容量瓶中，加超純水定容，搖勻。根據氨基酸態氮含量的檢測結果，用超純水進一步稀釋樣品到合適濃度（使稀釋液的胱氨酸濃度控制在2.5～200 pmol/μL、其他16種氨基酸的濃度控制在5～400 pmol/μL）。混勻后取稀釋液經0.22 μm有機膜過濾進2 mL樣品瓶，待上機。

柱前衍生條件：參考申兆棟等[24]的方法。吸取2.5 μL硼酸鹽溶液與1.0 μL樣品稀釋液，混合5次，等待0.2 min，吸取0.5 μL OPA衍生試劑，混合10次，吸取0.4 μL FOMC衍生試劑，混合10次，吸取32 μL進樣稀釋劑，混合8次。

高效液相色譜條件：采用Agilent AdvanceBio AAA氨基酸色譜柱（4.6 mm×100 mm，2.7-Miron）進行分離；流動相A為10 mmol/L Na2HPO4：10 mmmol/L Na2B4O7（1∶1），用濃鹽酸調pH到8.2；流動相B為乙腈∶甲醇∶水（45∶45∶10），采用梯度洗脫，0～0.50 min，98%流動相A，2%流動相B；0.50～20.50 min，98%～43%流動相A，2%～57%流動相B；20.50～20.60 min，43%～0%流動相A，57%流動相B，0%～43%超純水；20.60～22.00 min，57%；流動相B，43%超純水；22.00～22.10 min，57%～100%流動相B；22.10～24.30 min，100%流動相B；24.30～24.40 min，100%～2%流動相B，0%～98%超純水；24.40～27.00 min，2%流動相B，98%超純水；柱溫為40 ℃；流速1.5 mL/min；進樣量1 μL；檢測波長在0～16 min范圍內，激發波長為340 nm、發射波長為450 nm，16 min后激發波長為260 nm、發射波長為325 nm。

氨基酸的下降率計算公式如下：

定性、定量分析：根據17種氨基酸單標的出峰時間對氨基酸進行定性；采用外標法定量。

1.3.4 數據處理

采用Excel 2019和SPSS 22.0軟件處理數據，基于Duncan法多重比較檢驗，P＜0.05，差異顯著；利用Origin 2018和TBtools v1.098661軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 酸性蛋白酶對醬醪蛋白酶活力的影響

由圖1可知，在整個發酵過程中，酸性蛋白酶活力變化趨勢相同。發酵1 d時，K組和S組的酸性蛋白酶活力分別為74 U/mL和216 U/mL，隨著發酵時間在1～10 d范圍內的延長，醪液中的酸性蛋白酶活力均迅速下降，酸性蛋白酶活性分別下降至26 U/mL、9 U/mL；發酵至20 d時，醪液中的酸性蛋白酶活力已經低于檢測水平，未能檢出。其原因可能是：一方面，添加酸性蛋白酶直接提高了發酵醪液的酸性蛋白酶活力；另一方面，酸性蛋白酶能夠破壞細胞間質[25]、提高原料被分解的速率，促進曲料中蛋白酶分泌到醪液中，從而提高了發酵初期醪液的蛋白酶活力。有研究指出[8]，蛋白酶會對酶系造成一定的影響。在發酵初期添加酸性蛋白酶，對醬油發酵中期（20～40 d）和后期（40～62 d）的蛋白酶活力沒有影響。

圖1 發酵過程中蛋白酶活力的動態變化Fig.1 Dynamic changes of protease activities of soy sauce during fermentation process

在整個發酵過程中，中性蛋白酶活力變化趨勢相同。發酵1 d時，K組和S組的中性蛋白酶活力分別為350 U/mL和747 U/mL，發酵1～20 d，醪液中的中性蛋白酶活力快速下降到較低水平，分別降低至120 U/mL、122 U/mL；發酵時間＞20 d時，兩個組別的中性蛋白酶活力雖有波動，但基本趨于穩定。

添加外源酸性蛋白酶，初期醪液中的酸性和中性蛋白酶活力都明顯提高。K組和S組的蛋白酶活力變化趨勢與童佳[26]的研究結果相似；CUI C等[27]的研究結果表明，在高鹽環境中，醬油的酸性和中性蛋白酶活力在發酵前15 d迅速下降，因此，通過添加酸性蛋白酶可以提高醬醪的酸性和中性蛋白酶活力，從而提高蛋白質原料的利用率。

2.2 酸性蛋白酶對醬醪基本理化指標的影響

2.2.1 總酸含量、pH的變化

醬油中的有機酸主要由乳酸菌等微生物代謝產生[28]，總酸含量的高低可以反映醬油發酵過程中微生物的代謝水平。酸可以改變發酵體系的pH，從而影響微生物的生長、代謝途徑，以及美拉德反應等化學反應[29-30]，對醬油發酵有重要影響。

由圖2可知，添加酸性蛋白酶，可以增加醬醪中的總酸含量。在醬醪發酵前期（1～10 d），K組和S組的總酸含量快速增加；隨著發酵時間在10～50 d范圍內的延長，總酸含量呈平緩增加的趨勢，當發酵時間為50 d時，總酸含量均達到最大值，S組醬醪的總酸含量達到最大值，為2.44 g/100 mL，K組的總酸含量為1.59 g/mL；當發酵時間＞50 d后，S組總酸含量有所下降，而K組的總酸含量趨于平穩。發酵結束時，K組和S組的總酸含量分別為1.58 g/100 mL和2.16 g/100 mL。

圖2 發酵過程中總酸含量及pH的動態變化Fig.2 Dynamic changes of total acid contents and pH of soy sauce during fermentation process

在整個發酵過程中，K組和S組的pH值均呈下降趨勢，在發酵時間為1 d時，K組的pH為5.36，S組的pH為5.47；隨著發酵時間在1～6 d范圍內的增加，pH值呈快速下降的趨勢；當發酵時間＞6 d時，pH均緩慢下降，發酵結束時，K組和S組的pH分別為4.68和4.50。這與文獻報道的研究結果相似[31-32]。

當發酵時間＞10 d，與K組相比，S組的總酸含量較高，pH較低。結果表明，通過在醬油發酵初期加入外源酸性蛋白酶，可以使發酵體系的微生物活力更加旺盛，尤其是提高了乳酸菌等產酸微生物的代謝速率；可以加速發酵體系形成更適合酵母菌生長的酸性環境[19]，從而影響醬油發酵體系的菌落結構。

2.2.2 氨基酸態氮含量的變化

由圖3可知，在發酵前期（1～10 d），K組的氨基酸態氮含量快速增加；隨著發酵時間在10～50 d范圍內的延長，K組的氨基酸態氮含量緩慢上升；當發酵時間為50 d時，氨基酸態氮含量達到0.96 g/100 mL；發酵時間＞50 d時，氨基酸態氮含量變化趨于平穩，發酵結束時，其含量為0.97 g/100 mL。

圖3 發酵過程中氨基酸態氮含量的動態變化Fig.3 Dynamic changes of amino nitrogen contents of soy sauce during fermentation process

在發酵前期（1～10 d），S組的氨基酸態氮含量快速增加；隨著發酵時間在10～50 d范圍內的延長，S組的氨基酸態氮含量一直緩慢上升；發酵時間＞50 d時，氨基酸態氮含量出現下降，發酵結束時，其含量為1.13 g/100 mL。

整個發酵過程中，添加外源酸性蛋白酶組（S）的氨基酸態氮含量均高于未添加蛋白酶組（K）。外源酸性蛋白酶的加入，提高了醬醪的酸性蛋白酶活力，使曲料中蛋白質等大分子物質被分解得更徹底，從而提高了氨基酸態氮含量[31]；但是到了發酵后期（50～62 d），氨基酸態氮含量有所下降的原因可能是，一方面豐富的營養物質促進了醬醪微生物的生長代謝、提高了氨基酸態氮的消耗速率，另一方面蛋白酶活力較低、氨基酸態氮生成速率降低，此時氨基酸態氮的消耗速度大于生成速度[31-33]。

2.3 酸性蛋白酶對游離氨基酸的影響

2.3.1 游離氨基酸含量的動態變化

為了進一步研究添加外源酸性蛋白酶對醬油發酵的影響，對醬油釀造過程中17種游離氨基酸的含量變化進行熱圖分析，結果見圖4。

由圖4可知，S組在發酵時間為1～20 d時，除精氨酸和酪氨酸外的15種游離氨基酸含量不斷積累上升；發酵在20 d時，S組總游離氨基酸含量達到最高值，為64.56 g/L；當發酵時間在20～62 d范圍內，S組總游離氨基酸含量從發酵20 d的64.56 g/L下降至55.75 g/L，下降率約為13.64%，谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸含量顯著下降（P＜0.05），其中谷氨酸含量由11.13 g/L降至1.26 g/L，甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸含量顯著上升（P＜0.05），其他5種游離氨基酸的含量無顯著變化。發酵初期添加酸性蛋白酶促進了游離氨基酸的生成速率，從而促進微生物生長[34]，可能改變了醬醪微生物的菌群結構和代謝速率，影響氨基酸的含量及組成。醬油發酵過程中谷氨酸含量下降可能是由于醬油發酵過程中，谷氨酸和丙酮酸可以反應生成丙氨酸、α-酮戊二酸[35]；谷氨酸脫羧酶生成能將谷氨酸脫羧產生γ-氨基丁酸[12]；谷氨酸在酸性條件下不穩定能夠轉化為焦谷氨酸[36]。

圖4 發酵過程中游離氨基酸含量變化的熱圖Fig.4 Heatmap of changes of free amino acid contents in soy sauce during fermentation process

在發酵時間為1～40 d內時，K組的氨基酸（酪氨酸、精氨酸、組氨酸除外）含量呈上升趨勢，發酵時間為40 d時，17種游離氨基酸總含量達到最高，總游離氨基酸含量為66.07 g/L。在40～62 d范圍內，氨基酸總量下降至63.06 g/L，下降率約為4.55%，纈氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、脯氨酸含量顯著下降（P＜0.05），蘇氨酸含量顯著上升（P＜0.05），其他氨基酸含量均無顯著變化（P＞0.05）。

發酵初期（1～20 d），S組總游離氨基酸含量高于K組，且氨基酸生成速率更高，S組的總游離氨基酸含量在20 d即可達到最高值（64.56 g/L），而K組的總游離氨基酸含量在40 d時，達到最高（66.07 g/L），隨著繼續發酵，游離氨基酸總量均下降。發酵結束時，與K組相比，S組的總游離氨基酸含量減少了11.59%，但S組的甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸（8種）含量顯著增加（P＜0.05），其中丙氨酸含量提高了51.17%，其他7種游離氨基酸含量提高了14.00%～21.35%。與K組相比，S組的谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、苯丙氨酸含量顯著減少（P＜0.05），其中谷氨酸含量減少了89.06%，這是導致S組游離氨基酸總含量少于K組的主要原因，若不計谷氨酸含量，S組另外16種游離氨基酸總含量（54.49 g/L）高于K組（51.55 g/L）。

2.3.2 生醬油呈味氨基酸含量對比

游離氨基酸對大豆發酵食品獨特滋味和香氣的形成具有重要作用，是醬油特有味道的重要組成部分。為了進一步分析添加外源酸性蛋白酶對醬油品質的貢獻，考察外源添加酸性蛋白酶對醬油中鮮味氨基酸（Asp、Glu）、甜味氨基（Ser、Gly、Thr、Ala）、甜苦味氨基酸（Lys、Pro）、苦味氨基酸（His、Arg、Tyr、Val、Met、Phe、Ileu、Leu）和無味氨基酸（Cys-Cys）[37-38]的影響，發酵62 d的生醬油的呈味氨基酸含量見圖5。

圖5 發酵62 d的生醬油的呈味氨基酸含量Fig.5 Contents of flavor amino acid of raw soy sauce fermented for 62 d

由圖5可知，添加外源酸性蛋白酶使生醬油中的甜味氨基酸含量顯著增加（P＜0.05），增加1.97 g/L，其中甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸均顯著增加（P＜0.05）；甜苦味、無味氨基酸含量有所增加，分別增加了1.11 g/L、0.69 g/L，苦味氨基酸含量有所減少，減少了0.44 g/L；但鮮味氨基酸顯著下降（P＜0.05），減少了10.64 g/L，其中主要是谷氨酸含量顯著下降（P＜0.05），天冬氨酸含量無顯著變化。總體上呈味氨基酸含量下降，下降了7.31 g/L，這主要是谷氨酸被大量消耗所導致的。由此認為，添加外源酸性蛋白酶可能對醬油在呈味方面的影響較大，在實際投入生產應用中，應該關注其對醬油滋味的影響。

3 結論

在發酵初期添加酸性蛋白酶，可以提高酸性、中性蛋白酶活力，與對照組相比，實驗組酸性蛋白酶和中性蛋白酶活力分別提高2.9倍和2.1倍。發酵結束時，實驗組醬油的pH下降至4.50、總酸、氨基酸態氮含量分別增加36.71%、12.37%；游離氨基酸的總含量降低，主要呈鮮味的谷氨酸含量下降。該研究可為外源酸性蛋白酶在工業化釀造醬油中的應用提供理論依據。

在高鹽稀態醬油發酵初期，額外添加酸性蛋白酶，能夠加快蛋白質的分解速率、提高蛋白質的利用率、縮短發酵周期。但是過量的蛋白酶也可能豐富醬醪的營養物質使耐鹽細菌、耐鹽酵母等微生物生長繁殖過快，打破醬醪原本的微生態平衡，導致醬醪的目標產物被大量消耗而影響生醬油產品的質量。此外，發酵周期過短，也不利于醬油風味的形成。通過分析不同階段添加酸性蛋白酶對高鹽稀態醬油發酵的影響以提高原料利用率，降低對醬油滋味的影響。