基于GC/HPLC檢測和苦味評定解析黃酒苦味

陳文穎，周世水*，閆統帥，郭 波

（1.華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006；2.廣東石灣酒廠集團股份有限公司，廣東 佛山528031）

黃酒是世界三大古酒之一，是中華民族的瑰寶，其富含蛋白質、氨基酸和多糖等營養物質以及活性多肽、功能多糖、維生素、γ-氨基丁酸、類黑精等生理活性物質[1]，這賦予黃酒一定的營養保健功能。

苦味是黃酒的基本風味之一，適當的苦味給人以爽口的感覺[2]，但是市面上大部分黃酒口感不夠“爽”，苦味重，持續性強，使得黃酒口感粗糙[3]，銷售人群受限而導致我國黃酒銷售量人均約2 L[4]。目前，葡萄酒[5-6]、清酒[7-8]、白酒[9-10]和啤酒[11-12]的苦味物質在國內外都有比較系統的研究，但是黃酒的苦味物質研究相對較少，其中于海燕等[13]提出黃酒中的苦味主要由高級醇、氨基酸、苦味肽和黃酒發酵不正常時產生的丙烯醇、酪醇引起。黃酒中苦味物質的探究常采用分離純化黃酒中的物質逐一進行感官評定，這種方法前處理樣品方式復雜，且忽略了黃酒中各物質相互作用的影響[14]。2008年，有研究者首次將核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）測定葡萄酒數據并運用代謝組學的方法來進行分析，這打開了酒代謝組學的大門[15]。隨后，學者們利用酒代謝組學結合數據統計分析方法如主成分分析（principal component analysis，PCA）、層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）等數據統計分析方法探究酒的風味[16]、品質評價模型[17]以及酒齡[18]等特征，使得酒中越來越多的奧秘被揭開，這些方法為分析影響黃酒苦味的因素提供了思路。因此，本研究通過使用氣相色譜（gas chromatography，GC）和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定黃酒中揮發性成分、氨基酸和理化性質，結合苦味評定進行相關性分析和PLSR分析來確定黃酒中的各組分與苦味的關系。以期為降低黃酒苦味的釀造技術、開發優良口味黃酒提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

20種半干型黃酒（糖度15.1～40.0 g/L、酒精度12%vol～20%vol、編號HJ1～HJ20）：浙江紹興、寧波等7家酒廠市售產品；甲醇、乙醛、正丙醇、乙酸乙酯、異丁醇、異戊醇、乳酸乙酯、丁酸、β-苯乙醇、酒精、丙酮、乙酸丁酯、乙腈、正己烷、異硫氰酸苯酯（均為色譜級）、氨基酸標準品（純度均＞98%）、鹽酸奎寧（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

GC8100氣相色譜儀（GC）、LZP-930色譜柱（30 m×0.32 mm×1 μm）：滕州中科普儀器有限公司；LC-10A高效液相色譜儀（HPLC）：日本島津公司；安捷倫TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：安捷倫科技（中國）有限公司；pH酸度計：梅特勒-托利多國際貿易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 揮發性成分的測定

黃酒中揮發性成分采用GC法測定[19]。按照各組分標準品保留時間進行定性，內標法進行定量。測定揮發性成分的內標為17.6 mg/mL乙酸丁酯。樣品過0.22 μm 孔徑濾膜，將980 μL樣品和20 μL丙酮（內標）置于氣相色譜樣品瓶中。柱箱升溫程序：先以50 ℃保持5 min，再以10 ℃/min的速度升溫至200 ℃并保持5 min。進樣口溫度220 ℃，檢測器溫度230 ℃，載氣為高純氮氣（N2），載氣流速30 mL/min，氫氣流速30 mL/min，空氣流速300 mL/min，尾吹氮氣速度30 mL/min，進樣體積0.4 μL。

1.3.2 氨基酸含量測定

氨基酸采用HPLC法[20]測定。取酒液200 μL加100 μL 1.2%異硫氰酸苯酯乙腈溶液和100 μL 14%三乙胺乙腈溶液，混勻后靜置1 h，加入400 μL正己烷，旋渦混合器振蕩60 s后靜置10 min，取下層清液過0.45 μm 孔徑濾膜后備用。HPLC色譜條件為安捷倫TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A：0.01 mol/L 乙酸鈉緩沖液-乙腈（97∶3，V/V）；流動相B：乙腈-水（4∶1，V/V）；流速1.0 mL/min；檢測波長254 nm；柱溫40 ℃；進樣量10 μL。洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Program of gradient elution

1.3.3 黃酒理化指標的測定

黃酒的總酸（以乳酸計）、總糖（以葡萄糖計）：按照GB/T 13662—2018《黃酒》測定；黃酒中酒精含量采用GC法測定并稍作改動[21]。按照乙醇保留時間進行定性，內標法進行定量。測定酒精含量的內標為7.32 mg/mL丙酮。樣品過0.22 μm 孔徑濾膜，將100 μL樣品、800 μL水和100 μL內標丙酮置于氣相色譜樣品瓶中。柱箱升溫程序：先50 ℃保持4 min，再30 ℃/min的速度升溫至200 ℃并保持2 min。進樣口溫度220 ℃，檢測器溫度230 ℃，載氣為高純氮氣（N2），載氣流速30 mL/min，氫氣流速30 mL/min，空氣流速300 mL/min，尾吹氮氣速度30 mL/min，進樣體積0.4 μL。

1.3.4 苦味值的評定

苦味評定方法[22]?？辔稑藴室海河脵幟仕釋⒓儍羲{至與原酒pH（3.8～4.2）一致，用此作為標準溶液基液；將鹽酸奎寧配制為不同濃度的苦味標準品，以此為標準進行評分。鹽酸奎寧質量濃度5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L和40 mg/L分別對應苦味值5、10、20、30和40。

采用標簽量值評估法[23]對成員（5男5女；年齡22～50歲）進行為期兩個月的口味敏感性訓練，以2 mg/L鹽酸奎寧為苦味標準物訓練苦味。訓練后所有的評定員都可以準確識別苦味。每次評定前1 h內限制飲食，評定員用蒸餾水漱口后，準確移取10 mL待測樣品于口腔中充分浸潤5～10 s，仰頭讓樣品浸潤咽喉部位兩次，保證樣品覆蓋整個咽喉的表面后吐出，漱口，不同樣品之間間隔不低于3 min，每個樣品評定3次，評定員確定與樣品最接近的苦味標準液并以此確定苦味值。

1.3.5 相關性分析

Pearson相關系數法常用于評估2個連續變量之間的線性關系。將各測定成分含量與苦味值進行Pearson相關性分析，通過選擇雙變量相關分析中的Pearson和雙側檢驗方法，獲取相關系數。

1.3.6 PLSR苦味分析

將測定各成分作為X變量，苦味值作為Y變量，進行PLSR分析，包括數據的降維和苦味值識別的分析，建立模型并用模型預測苦味值Y。

1.3.7 統計數據分析

采用SPSS 24.0進行數據的統計學分析、相關性分析；條形圖由Graphpad prism 8.0軟件分析繪制；PLSR分析由The Unscrambler X 10.4軟件分析。除方法中特別說明外，各試驗設定3個平行，數據用“平均值±標準偏差”表示。

2 結果與分析

2.1 黃酒中揮發性成分測定結果

黃酒樣品中揮發性成分、酒精度的測定結果見表2。由表2可知，黃酒中主要揮發性成分及含量為乙醛19～98mg/L、甲醇0～40 mg/L、正丙醇38～122 mg/L、乙酸乙酯31～158 mg/L、異丁醇61～132 mg/L、異戊醇108～238 mg/L、乳酸乙酯121～580 mg/L、丁酸63～714 mg/L、β-苯乙醇13～200 mg/L。其中高級醇含量最高的是樣品HJ2 578 mg/L，最低的是樣品HJ12 242 mg/L。乙酸乙酯含量最高的是樣品HJ16 158 mg/L，最低的是樣品HJ1 31 mg/L。乳酸乙酯含量最高的是樣品HJ5 580 mg/L，最低的是樣品HJ13 121 mg/L。

表2 黃酒樣品中揮發性成分含量測定結果Table 2 Determination results of volatile components contents in Huangjiu samples mg/L

2.2 黃酒中氨基酸含量的測定結果

黃酒中氨基酸的測定結果見表3。由表3可知，各黃酒樣品中一共檢出18種游離氨基酸，包含8種必需氨基酸和10種非必需氨基酸。黃酒中必需氨基酸總量在332～2 172 mg/L，必需氨基酸總量最高的是樣品HJ8，為2 172 mg/L；最低的是樣品HJ5 為332 mg/L。黃酒中苦味氨基酸總量在458～2269mg/L，苦味氨基酸總量最高的是樣品HJ8，為2269mg/L；最低的是樣品HJ5，為458 mg/L。多數苦味氨基酸如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸也是必需氨基酸，相對而言，黃酒中苦味氨基酸總量比必需氨基酸總量多。黃酒中游離氨基酸總量在1 110～4 924 mg/L，游離氨基酸總量最高的是樣品HJ8，為4 924 mg/L；最低的是樣品HJ5為1 110 mg/L。酒樣中氨基酸含量有差異，其中天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸含量均較高，這與宮曉波等[24]的研究結果相一致。

表3 黃酒樣品中氨基酸含量測定結果Table 3 Determination results of amino acids contents in Huangjiu samples mg/L

續表

2.3 黃酒理化指標測定

黃酒樣品中總酸、總糖和酒精含量測定結果見表4。由表4可知，黃酒中總酸含量3.6～8.2 g/L，符合半干型黃酒GB/T 13662—2018《黃酒》標準（稻米黃酒3.0～7.5 g/L，非稻米黃酒3.0～10.0 g/L）?？偺呛?4.5～44.0 g/L，僅樣品HJ4總糖含量14.5 g/L略低于半干型黃酒標準，樣品HJ7總糖含量44.0 g/L略超半干型黃酒標準，其他均符合半干型黃酒GB/T 13662—2018《黃酒》標準（15.1～40.0 g/L）。酒精含量9.5～15.1 g/L，即酒精度為12.0%vol～19%vol，符合半干型黃酒GB/T 13662—2018《黃酒》標準（＞8.0%vol）。

表4 黃酒樣品理化指標測定結果Table 4 Determination results of physicochemical indexes of Huangjiu samples g/L

2.4 黃酒苦味值分析

黃酒樣品苦味值的測定結果見圖1。由圖1可知，樣品HJ1和HJ5的苦味值最高，都為40；其次是樣品HJ2的苦味值為36；樣品HJ3和HJ4的苦味值為34、樣品HJ8、HJ11、HJ15和HJ16的苦味值為32；樣品HJ9的苦味值為24；樣品HJ10的苦味值為20；樣品HJ6、HJ13的苦味值為18；樣品HJ12、HJ14的苦味值為16；樣品HJ7的苦味值最低，為14；其中苦味值＜25的黃酒樣品有7種，占44%，苦味值＞30的黃酒樣品有9種，占56%。經品評可以發現，黃酒苦味值相差2個單位在品評過程中就會有顯著性差異，黃酒的苦味值在該品評標準下8～34為宜，苦味值低于8的黃酒其酒特征不明顯，有些甚至很寡淡，不具有酒的風味?？辔吨蹈哂?4的黃酒苦味較重，難以吞咽甚至產生不愉悅感。黃酒的苦味值差異主要由于黃酒各組成成分不同而引起[25]，通過探究黃酒樣品中揮發性成分、氨基酸及理化指標與苦味的相關性，從而得以從菌種、原料組成和發酵工藝來控制黃酒發酵過程中各組成成分的產生[22]，降低黃酒苦味并提升黃酒品質。

圖1 黃酒樣品的苦味值測定結果Fig.1 Determination results of bitterness values of Huangjiu samples

2.5 黃酒中揮發性成分、氨基酸及理化指標與苦味值相關性結果分析

黃酒中揮發性成分、氨基酸及理化指標與苦味值相關性分析結果見圖2。由圖2可知，苦味值與異戊醇（R=0.808）、異丁醇（R=0.642）、正丙醇（R=0.623）顯著正相關，這與高級醇是酒的苦味來源結果一致[13，22，26-27]。乳酸乙酯（R=0.771）作為一種呈香物質，是黃酒的重要香氣成分，但乳酸乙酯含量過高便會抑制酒的整體香氣并產生明顯苦澀感[28]。因乳酸乙酯在半干型黃酒中含量較高（121～549 mg/L）且超過了自身的苦味閾值（70 mg/L）[26]，所以其在增香的同時也會產生一定的苦味。

圖2 黃酒樣品中揮發性成分、氨基酸及理化指標與苦味值相關性分析結果Fig.2 Correlation analysis results between volatile components,amino acids,physicochemical indexes and bitterness value of Huangjiu samples

通常黃酒中苦味氨基酸占總氨基酸44%，會給黃酒帶來一定程度的苦味[3，13，26]，其中部分氨基酸與苦味值呈弱正相關，包括精氨酸（R=0.464）、纈氨酸（R=0.414）、脯氨酸（R=0.376）、亮氨酸（R=0.321）、異亮氨酸（R=0.296）、苯丙氨酸（R=0.246）等苦味氨基酸，其他氨基酸與苦味相關極小或負相關，特別是甘氨酸（R=-0.536）與苦味呈顯著負相關。由于氨基酸的感官閾值較高[26]，且氨基氮與苦味呈現負相關而與鮮味正相關[29]，這可能是導致黃酒中氨基酸與苦味相關性低的原因。

此外，總酸（R=0.641）對苦味有促進作用，總糖（R=-0.735）對苦味有明顯抑制作用，糖是一種傳統的苦味掩蓋物[30]，在黃酒的風味中同樣也發揮了巨大作用。酒精與苦味值呈極顯著正相關（R=0.850），而且酒精濃度越高，苦味越強烈，這與CHEN T等[31]的高濃度酒精會產生強烈的苦味結論相一致。

2.6 偏最小二乘法回歸分析模型建立

不同黃酒樣品中揮發性成分、氨基酸及理化指標與苦味值相關性偏最小二乘法回歸分析載荷圖見圖3。PLSR可進一步驗證Pearson相關性分析的物質來建立苦味與測定成分之間的可靠性。以各測定成分為X預測變量，苦味值為Y響應變量進行PLSR分析，提取兩個主成分，主成分1解釋了31%的X方差、73%的Y方差，主成分2解釋了31%的X方差、解釋了16%的Y方差，兩個主成分共解釋了62%的X方差、89%的Y方差。由圖3可知，位于2個橢圓之間的成分如酒精度、異戊醇、異丁醇、正丙醇、乳酸乙酯和絕大部分的氨基酸均能很好的被PLSR模型解釋，酒精度、異戊醇、異丁醇、正丙醇、乳酸乙酯等與苦味值距離較近，表明相關程度高，而氨基酸類物質與苦味值距離較遠，表明相關程度低。這也與邱修柄等[22]的研究中高級醇比苦味氨基酸更能決定苦味強度的結果相同?？辔吨滴挥趦葯E圓，對PLSR模型總方差貢獻顯著，能很好的被相關性高的測定成分解釋。

圖3 黃酒樣品中揮發性成分、氨基酸及理化指標與苦味值的偏最小二乘法回歸分析載荷圖Fig.3 Load diagram of partial least squares regression analysis of volatile components,amino acids,and physicochemical indexes in Huangjiu samples and bitterness value

不同黃酒樣品中揮發性成分、氨基酸及理化指標與苦味值相關性偏最小二乘法回歸分析得分圖見圖4。由圖4可知，隨著苦味值的增大，其主成分1得分值和主成分2得分值呈現逐漸增大的趨勢，不同苦味值的黃酒能明顯區分開來。且所有樣本都落在95%的置信區間內，無異常值，這表明黃酒成分與苦味值對應關系分析結果是可信的。

圖4 黃酒樣品中揮發性成分、氨基酸及理化指標與苦味值的偏最小二乘法回歸分析得分圖Fig.4 Score plot of partial least square regression analysis of volatile components,amino acids,physicochemical indexes and bitterness value of Huangjiu samples

2.7 黃酒苦味值偏最小二乘法回歸預測模型的驗證

為了定量預測黃酒樣品中揮發性成分、氨基酸及理化指標與苦味值相關性，將16種半干型黃酒樣品分別按照表5中揮發性成分、氨基酸及理化指標（X1～X30）進行PLSR模型驗證，并得到黃酒苦味值（Y）預測模型的回歸方程如下：Y=0.037 3X1+0.033 0X2+0.110 4X3-0.000 2X4+0.121 6X5+0.1565X6+0.1477X7+0.0717X8+0.0602X9+0.1499X10-0.0345X11-0.0133X12-0.0185X13-0.0976X14-0.0091X15+0.0603X16-0.0434X17-0.0336X18+0.0401X19-0.0202X20+0.0472X21-0.0189X22-0.0343X23+0.0202X24+0.0239X25+0.0078X26-0.0034X27-0.0105X28+0.1023X29-0.138 5X30-0.032 2。此定量模型的自變量擬合度（RX2）為0.62，因變量擬合度（RY2）為0.883，預測擬合精度（Q2cum）=0.783＞0.6，說明該模型擬合效果好且預測結果能夠被接受。將另外從市場購買的不同價位具有代表性的黃酒樣品HJ17、HJ18、HJ19、HJ20使用模型進行驗證，得到預測苦味值和評定苦味值分別見表5。由表5可知，樣品HJ17模型預測苦味值為32.0，評定苦味值30，偏差率6.6%；樣品HJ18模型預測苦味值為21.5，評定苦味值24，偏差率10.3%；樣品HJ19模型預測苦味值為28.0，評定苦味值30，偏差率6.6%；樣品HJ20模型預測苦味值為27.5，評定苦味值26，偏差率5.8%，最大偏差率接近10%。結果表明，黃酒苦味值預測模型的預測值準確，能達到黃酒苦味值感官評定準確率的90%。

表5 以揮發性成分、氨基酸及理化指標預測黃酒樣品苦味值模型驗證Table 5 Model validation of predicting bitterness value of Huangjiu samples with volatile components,amino acids and physicochemical indexes

續表

3 結論

本試驗研究了黃酒樣品中揮發性成分、氨基酸及理化指標與其苦味的關系，Pearson相關性分析結果表明，黃酒的苦味值與揮發性物質如酒精、異戊醇、異丁醇、正丙醇和乳酸乙酯等相關性較高（R=0.623～0.808），與苦味氨基酸如脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸等相關性低（R=0.246～0.464），與部分氨基酸為負相關，特別是甘氨酸（R=-0.536）呈顯著負相關，酒精與苦味相關性最高（R=0.850）、總酸對苦味有促進作用（R=0.649），總糖對苦味有明顯抑制作用（R=-0.735）。PLSR模型驗證了苦味值與揮發性成分、氨基酸及理化指標的關系，不同苦味值的黃酒可以明顯地被模型區分開，黃酒苦味值預測模型的預測值準確，達到黃酒苦味值感官評定準確率的90%。研究結果表明黃酒苦味值可以通過儀器測定黃酒揮發性成分、氨基酸及理化指標直接確定，這為黃酒苦味值的判定提供了一種客觀有效的技術方法。