QuEChERS結合氣相色譜三重四極桿串聯質譜法測定高粱中45種農藥殘留

劉 燁，吳衛國，梁 軍，孫映球，楊 翠，郭 沛

（1.湘潭市食品藥品檢驗所，湖南 湘潭 411100；2.湖南農業大學 食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；3.中南大學 化學化工學院，湖南 長沙 410083；4.廣電計量檢測（湖南）有限公司，湖南 長沙 410083）

高粱（Sorghum bicolorL.）為禾本科一年生草本植物，俗稱蜀黍、蘆稷、蘆粟等[1]，不僅產量高，而且具有獨特的耐鹽堿、耐澇、耐旱等抗逆性[2-3]。高粱營養價值豐富，富含蛋白質[4-6]、碳水化合物[7]、膳食纖維[8]、礦物元素[9]等營養成分，是我國釀酒產業的主要原料，在我國已有大面積人工種植。為提高高粱產量，農藥在其生長過程中被廣泛應用于病、蟲、草害等防治，然而因存在農藥的不合理使用，故高粱中存在農藥污染風險。因此，建立高粱中農藥殘留量的快速檢測方法，對于保證高粱的質量安全具有重要作用。

目前，農藥提取常見的方法有加速溶劑萃取、超聲提取、固相萃取及QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）方法[10]。如今QuEChERS 方法從最初用于蔬菜水果中農藥殘留檢測的凈化提取過程，已發展成為一套根據樣品基質不同而靈活改變的系列多農藥殘留前處理方法。其應用已延伸到畜產品、茶葉、煙草、糧谷等眾多領域[11]。本研究采用優化的QuEChERS 法進行簡單而有效的樣品預處理，結合氣相色譜-三重四極桿串聯質譜（gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）技術的多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）采集方式，不僅可以減少基質干擾對農藥的測定，同時也降低了檢出限，為建立高效的高粱多農殘檢測技術提供參考，同時也可以提高日常食品安全監管工作的效率，為高粱中農藥殘留的分析檢測提供了一種簡單、快速、可靠的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高粱樣品（錦雜100、遼雜11、兩糯1號、紅塔2號、遼雜12、新豐218、睿糯2號、遼雜13、冀粱2號、睿糯7號、遼甜3號、精品紅星2號、超級糯1號、矮抗鐵桿16號、矮抗12號、晉糯1號、晉糯5號、晉糯12號）：均為市售，隨機選取顆粒飽滿無霉變的高粱粉碎后裝入潔凈的盛樣容器內備用。

正己烷（色譜純）：美國Fisher公司；乙腈（色譜純）：美國TIDE公司；二氯甲烷（色譜純）、甲苯（優級純）：德國Merck公司；WondaPak QuEChERS提取鹽試劑包Ⅱ（5 g無水MgSO4，2.5 g醋酸鈉），WondaPak QuEChERS 凈化管Ⅰ（100 mg 乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA），800 mg MgSO4）、WondaPak QuEChERS凈化管Ⅱ（100 mg PSA，20 mg 石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB），900 mg MgSO4）、WondaPak QuEChERS凈化管Ⅲ（450 mg PSA，450 mg C18，1 000 mg MgSO4）、WondaPak QuEChERS凈化管Ⅳ（400mgPSA，400mgC18，200 mgGCB，1 200 mg MgSO4）：美國Agilent公司；0.22 μm有機相微孔濾膜：天津博納艾杰爾科技有限公司；環氧七氯（1 000 μg/mL，1.2 mL）：壇墨質檢科技股份有限公司；農藥（甲胺磷、敵敵畏、殺蟲脒、甲拌磷、甲基乙拌磷、五氯硝基苯、二嗪磷、地蟲硫磷、乙嘧硫磷、除線磷、三唑磷、伏殺硫磷、皮蠅磷、甲基立枯磷、甲基對硫磷、滅菌磷、滅線磷、倍硫磷、三唑磷、乙拌磷、α-六六六、β-六六六、毒死蜱、四氯硝基苯、γ-六六六、δ-六六六、殺螟腈、甲基毒死蜱、毒蟲畏、丙溴磷、p,p'-滴滴涕、o,p'-滴滴涕、伐滅磷、噻嗪酮、p,p'-滴滴伊、p,p'-滴滴滴、三硫磷、啶蟲脒、嗪草酮、甲氰菊酯、三唑酮、狄氏劑、艾氏劑、異狄氏劑、聯苯菊酯）標準品（純度均≥98.0%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設備

TQ8050氣相色譜-三重四極桿串聯質譜（GC-MS/MS）儀（配AOC-20i+s自動進樣器）：日本島津公司；JE703梅特勒分析天平：瑞士梅特勒公司；SPEX液氮冷凍研磨儀：德國萊特公司；AH-30全自動均質器：睿科集團股份有限公司；Eppendorf 5427 臺式高速冷凍離心機：北京儀信網通科技有限公司；Vap Basic旋轉蒸發儀：鄭州旋轉蒸發儀有限公司；XT-NS2定量氮吹濃縮儀：上海新拓分析儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準儲備液的配制

環氧七氯內標溶液的配制：準確量取環氧七氯標準品（1000μg/mL）100μL于10mL容量瓶中，用正己烷定容，即得質量濃度為10 μg/mL環氧七氯儲備液，于2～4 ℃冷藏保存。

45種混合農藥標準儲備液的配制：分別稱取10 mg農藥標準品于100 mL容量瓶中，用正己烷定容，即得質量濃度為100 μg/mL混合農藥A液，取1 mL混合農藥A液于10 mL容量瓶中，用正己烷定容，即得質量濃度10 μg/mL混合農藥標準儲備液，于2～4 ℃冷藏保存。

1.3.2 樣品的制備

稱取10.0 g（精確至0.001 g）高粱粉末樣品于50 mL離心管中，加入12 mL超純水，旋渦混勻，靜置30 min后加入10 mL乙腈-乙酸乙酯（1∶1，V/V）溶液混勻，加入WondaPak QuEChERS提取鹽試劑包Ⅱ均質20 min；6 000 r/min離心10 min；取上清液6 mL于WondaPak QuEChERS 凈化管Ⅲ中，立即渦旋5 min后，6 000 r/min離心5 min；取上清液3 mL，40 ℃氮吹濃縮至近干，加入0.1 mL質量濃度為10 μg/mL的環氧七氯內標溶液，用乙酸乙酯定容至1 mL，過0.22 μm有機相微孔濾膜，供GC-MS/MS分析。

1.3.3 儀器條件

氣相色譜條件：DB-5 MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣模式為不分流；溶劑延遲時間3 min；色譜柱溫度為初始溫度90 ℃，保持1 min，以20 ℃/min的速率升溫至180 ℃，保持2 min，再以15 ℃/min的速率升溫至280 ℃，保持8 min；柱流量為1.15 mL/min；載氣為氦氣（He），純度≥99.999%；進樣口溫度280 ℃；進樣量1 μL。

質譜條件：電離方式為電子電離（electronion ionization，EI）源；接口溫度285 ℃；電子能量70 eV；離子源溫度290 ℃；檢測器電壓（相對于調諧結果）0.5 kV；掃描模式：多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM），具體參數見表1；優化條件下的環氧七氯（內標）及45種混合農藥標準品的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 環氧七氯及45種混合農藥標準品的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatogram of heptachlor epoxide and 45 mixed pesticide standards

表1 環氧七氯及45種農藥組分的CAS號及MRM參數Table 1 CAS numbers and MRM parameters of heptachlor epoxide and 45 pesticide components

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2 結果與分析

2.1 QuEChERS前處理提取溶劑的選擇

農藥種類繁多，根據不同農藥的性質選擇不同提取溶劑對分析結果的準確性至關重要。因一些樣品成分復雜，用單一溶劑提取樣品中農藥殘留效果不佳，需要幾種溶劑混合提取才能滿足農藥分析。本試驗分別對農藥常用提取溶劑，二氯甲烷、乙腈、乙腈-乙酸乙酯（1∶1，V/V）等溶劑提取效果進行考察。以乙腈、二氯甲烷、乙腈-乙酸乙酯（1∶1，V/V）分別作為QuEChERS法萃取溶劑時。實驗結果表明，用乙腈-乙酸乙酯（1∶1，V/V）作為提取溶劑時目標農藥回收率最高，其45種農藥回收率為81.91%～111.93%；而使用單一溶劑乙腈和二氯甲烷作為提取溶劑時，其45種農藥回收率為67.91%～86.93%，目標農藥回收率相對偏低。研究表明二氯甲烷毒性相對較大，長期接觸不利于實驗人員的健康[12-14]；單一溶劑乙腈提取效果沒有混合溶劑乙腈-乙酸乙酯（1∶1，V/V）提取效果好，所以選擇乙腈-乙酸乙酯（1∶1，V/V）作為QuEChERS法的提取溶劑。

2.2 QuEChERS法中凈化劑的篩選

QuEChERS方法中常用到的凈化材料有乙二胺-N-丙基甲硅烷（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、石墨化碳黑（GCB）、無水MgSO4等[15]。凈化劑對樣品的凈化效果對檢測結果的準確性影響較大，本試驗分別考察凈化管Ⅰ、凈化管Ⅱ、凈化管Ⅲ和凈化管Ⅳ四種凈化試劑盒的凈化效果。實驗結果表明，凈化管Ⅲ凈化后效果最佳，其45種農藥回收率為83.45%～112.80%；凈化管Ⅰ的農藥回收率為67.87%～89.77%；凈化管Ⅱ的農藥回收率為77.34%～90.55%；凈化管Ⅳ的農藥回收率為81.65%～96.78%；因此，本試驗選擇凈化管Ⅲ作為凈化劑。凈化管Ⅲ中所含凈化劑PSA能有效去除高粱樣品提取液有機酸、少量色素和糖類等雜質[16]；C18能有效吸附高粱樣品提取液長鏈脂類化合物，甾醇以及其他非極性雜質等；無水MgSO4主要是吸附樣品中多余的水分。在選擇凈化劑時應根據不同樣品的組分差異選擇合適的凈化劑，同時應盡量避免凈化劑吸附待測組分[17-18]。

2.3 QuEChERS法提取液凈化體積的篩選

WondaPak QuEChERS 凈化管Ⅲ（450 mg PSA，450 mg C18，1 000 mg MgSO4）中固定量的凈化劑對不同體積高粱樣品提取液的凈化效果不同，分別考察比較6 mL、8 mL、10 mL高粱樣品提取液在WondaPak QuEChERS凈化管Ⅲ的凈化效果，樣品提取液在不同凈化體積6 mL、8 mL、10 mL的回收率分別為70.92%～89.65%、88.11%～108.98%、79.88%～91.98%，由實驗結果可知，在固定量凈化劑下隨著凈化液體積的增加凈化后顏色較深，雖能保住凈化后各種農藥的凈化效果，但是對檢測儀器的離子源及色譜柱污染較大。因此，本試驗選擇吸取8 mL提取液進行凈化，既能保證凈化效果，又對檢測儀器污染較小。

2.4 方法驗證

2.4.1 高粱中45種農藥的線性關系及方法檢出限

為消除基質影響，將質量濃度10 μg/mL混合農藥標準儲備液用按1.3.2方法處理后的陰性高粱提取液稀釋至質量濃度為0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、0.50 μg/mL和1.00 μg/mL系列標準工作液，其中分別含內標環氧七氯1 μg/mL。以目標物（農藥）的質量濃度與內標物環氧七氯質量濃度的比值和對應目標物（農藥）峰面積與內標物環氧七氯峰面積的比值繪制標準曲線，峰面積比為y軸，濃度比為x軸[19-20]。以空白基質產生的3倍信噪比（S/N=3）計算檢出限[21-26]。由表2可知，45種農藥在質量濃度0.05～1.00 μg/mL范圍內線性關系良好，相關系數R2均＞0.995，檢出限在0.001 2～0.042 4 mg/kg。

表2 45種農藥的線性回歸方程及檢出限Table 2 Linear regression equations and detection limits of 45 pesticides

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2.4.2 加標回收率與精密度試驗結果

選取陰性高粱樣品進行加標回收試驗，分別添加0.01 mg/kg、0.10 mg/kg和0.50 mg/kg的3個水平濃度，每個添加水平做6次重復試驗，計算其加標回收率、相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。由表3可知，陰性高粱樣品中45種農藥的3水平加標回收率為76.32%～108.45%，精密度實驗結果的RSD為0.12%～10.95%，均滿足農藥殘留痕量分析要求。

表3 精密度及加標回收率試驗結果Table 3 Results of precision and standard recovery rate tests

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2.5 實際樣品的檢測

利用該實驗所建立的方法對市售18種高粱樣品中45種農藥殘留進行檢測，結果見表4。由表4可知，根據GB 2763—2021《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》中規定農藥最大殘留限量（maximum residue limit，MRLs）對高粱檢測結果進行判定，在所檢測的45種農藥殘留中，雖有10種農藥殘留分別在18種高粱品種中檢出呈陽性，其中毒蟲畏、狄氏劑分別在睿糯7號、精品紅星2號檢測結果超過GB 2763—2021規定農藥最大殘留限量（MRLs）值，其檢測結果分別0.025 mg/kg、0.035 mg/kg。其余檢測結果呈陽性的農藥中有2項未有最大殘留限量（MRLs）規定的農藥不作判定；剩余6種農藥檢測呈陽性農藥均未超過相關規定的農藥最大殘留限量值。

表4 高粱樣品中45種農藥的檢測結果Table 4 Determination results of 45 pesticides in sorghum samples

3 結論

本實驗以高粱為研究對象，通過對試驗條件的選擇和優化，建立最優QuEChERS方法快速檢測高粱中45種農藥殘留的分析檢測方法，該方法前處理操作簡單，重復性好，靈敏度高，在0.01 mg/kg、0.1 mg/kg和0.50 mg/kg的加標濃度下，高粱樣品中45種農藥的平均為回收率為76.32%～108.45%，相對標準偏差（RSD）為0.12%～10.95%，檢出限在0.001 2～0.042 4 mg/kg，完全滿足日常的農藥殘留痕量分析工作。本研究采用建立的最優QuEChERS前處理結合氣相色譜三重四極桿串聯質譜法同時檢測市售18種不同品種高粱中農藥殘留。實驗表明，串聯質譜的檢測方法能夠避免雜質的干擾，尤其是分析高粱等復雜樣品時，能有效地消除基質干擾，減少假陽性的檢出率，同時能提高分析的選擇性和檢測靈敏度，簡化樣品前處理過程，降低分析成本。