紅葡萄酒中氨基甲酸乙酯檢測方法的優(yōu)化

馬延琴，許尤尤，葉丕平，王 斌，史學(xué)偉

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是一種在葡萄酒釀造過程中微生物的代謝副產(chǎn)物，也是酒精發(fā)酵飲料中比較常見的有毒污染物，可造成腫瘤、淋巴癌、肝癌、皮膚癌等疾病[1]。2007年世界衛(wèi)生組織國際癌癥機(jī)構(gòu)將氨基甲酸乙酯歸為2A類致癌物質(zhì)[2-4]。1985年，加拿大首次規(guī)定了葡萄酒、白蘭地和威士忌中的EC的限量值[5]。EC在葡萄酒基質(zhì)中以痕量的形式存在，葡萄酒化學(xué)組分復(fù)雜，EC檢測干擾較大，開發(fā)葡萄酒中氨基甲酸乙酯高靈活度檢測方法勢在必行。

在此之前，氣相色譜法（gas chromatography，GC）[6-9]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[10-14]、氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[15-19]以及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[20-21]等是測定EC的主要方法。早在2002年就有研究HPLC方法檢測氨基甲酸乙酯的報(bào)道，通過柱前衍生化和熒光檢測進(jìn)行了葡萄酒中EC的檢測[22]，其中高效液相色譜-熒光法（high performance liquid chromatography-fluorescence detection，HPLC-FLD）具有靈敏度高、重復(fù)性好、應(yīng)用范圍廣泛，而且解決了葡萄酒樣品處理過程中效率低和復(fù)雜的弊端。

薛錫佳等[23]對比了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法與固相萃取法檢測白酒中的EC含量的差異，研究表明液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有樣品前處理簡單，操作成本低等特點(diǎn)，但重現(xiàn)性低于高效液相色譜法。項(xiàng)東方[24]探討了酒中氨基甲酸乙酯的檢測方法，氣相色譜-質(zhì)譜法雖能避免物質(zhì)干擾，但存在處理時(shí)間長的缺點(diǎn)。陳達(dá)瑋等[25]采用HPLC對葡萄酒中EC含量進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，采用高效液相色譜-熒光法（HPLC-FLD）測定酒中EC時(shí)，具有簡便快速，成本較低等特點(diǎn)，比較適合在企業(yè)中推廣使用。該研究根據(jù)葡萄酒中EC濃度含量不盡相同的特點(diǎn)，擬結(jié)合固相萃取后衍生化反應(yīng)，采用高效液相色譜-熒光法（HPLC-FLD）測定葡萄酒中EC的含量，通過對葡萄酒進(jìn)行固相萃取前處理，達(dá)到減少不必要的干擾、降低污染色譜系統(tǒng)的概率和提高靈敏度檢測的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠葡萄酒；新疆張?jiān)０捅つ芯魄f；甲醇（純度≥99.9%）、乙腈（純度≥99.9%）（色譜純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；氨基甲酸乙酯（純度99%）、9-羥基噸（純度97%）、乙酸鈉、甲苯、乙酸乙酯（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；正己烷、乙醚（均為分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；試驗(yàn)使用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100系列高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；NDK200-1氮吹儀：杭州米歐儀器有限公司；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；SOP電子天平（精確到0.000 1 g）：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑的配制

衍生試劑儲備液：準(zhǔn)確稱取9-羥基噸0.198 0 g于50 mL容量瓶中，甲醇溶解至刻度，配制成0.02 mol/L的儲備液，放進(jìn)冰箱-4 ℃下進(jìn)行保存。

EC標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取EC 0.1 mg于100 mL容量瓶，甲醇進(jìn)行溶解至刻度，配制成1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，放進(jìn)冰箱-20 ℃進(jìn)行保存。

1.3.2 試樣凈化濃縮[26]

準(zhǔn)確量取葡萄酒樣品2 mL，加到萃取柱上，靜置并吸附10 min，用正己烷（10 mL）進(jìn)行淋洗，并擠干小柱。然后用10 mL乙酸乙酯∶乙醚（5∶95，V/V）洗脫，匯集洗脫液到10 mL的具塞刻度試管中，在室溫下用氮吹儀將洗脫液進(jìn)行濃縮，最后用甲醇定容至1 mL，經(jīng)過0.45 μm的微孔濾膜進(jìn)行過濾，得到的濾液可直接進(jìn)液相色譜儀進(jìn)行測定。

1.3.3 液相色譜的檢測條件

樣品衍生：準(zhǔn)確吸取100 μL 9-羥基噸衍生儲備試劑于棕色進(jìn)樣瓶中（1.5 mL），吸取500 μL經(jīng)過濃縮后的濾液，然后吸取50 μL的鹽酸溶液（1.5 mol/L），振蕩均勻后，放置暗處反應(yīng)5 min，然后進(jìn)樣分析。

樣品檢測：液相色譜檢測條件的設(shè)置參考陳達(dá)煒等[27]的方法。C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：乙酸鈉溶液（0.02 mol/L，pH 7.2）；流動相B：色譜級乙腈；檢測器為熒光檢測器，其中入射光波長設(shè)置為233 nm，發(fā)射光波長設(shè)置為600 nm，進(jìn)樣量設(shè)置為20 μL，柱溫為30 ℃。氨基甲酸乙酯分析梯度洗脫條件見表1。

表1 氨基甲酸乙酯分析洗脫程序Table 1 Elution procedure of ethyl carbamate analysis

1.3.4 樣品前處理?xiàng)l件和檢測反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化[28]

采用固相萃取葡萄酒中的EC時(shí)，影響EC提取的因素主要包括：吸附時(shí)間、淋洗溶劑的種類以及洗脫溶劑的種類和比例。本試驗(yàn)通過向葡萄酒樣品中添加EC（100 μg/L），根據(jù)回收率來確定樣品的最佳前處理?xiàng)l件。

（1）吸附時(shí)間的優(yōu)化

通過向固相萃取柱上樣后，設(shè)置靜置吸附時(shí)間為4 min、6 min、8 min、10 min、12 min時(shí)，通過回收率平均值以及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分析，確定最佳吸附時(shí)間。

（2）淋洗溶劑的選擇

在葡萄酒樣品經(jīng)過吸附后，采用溶劑極性較弱的試劑進(jìn)行淋洗，有效去除葡萄酒中的雜質(zhì)如顏色、糖分等，而待分析物質(zhì)EC在固相萃取柱上仍然保留。在此次實(shí)驗(yàn)中使用弱極性試劑正己烷、乙酸乙酯及甲苯，通過比較回收率平均值和RSD確定最合適的淋洗溶劑。

（3）洗脫溶劑的優(yōu)化

根據(jù)EC的特性，選取乙酸乙酯、乙醚、乙酸乙酯∶乙醚（5∶95，V/V）3種溶劑作為洗脫溶劑，研究洗脫溶劑種類對洗脫效果的影響，通過比較回收率平均值和RSD確定最合適的洗脫溶劑。

（4）洗脫溶劑比例的優(yōu)化

在確定固相萃取洗脫步驟中的最佳洗脫溶劑后，進(jìn)而優(yōu)化洗脫溶劑的比例，本試驗(yàn)選定的乙酸乙酯與乙醚的比例分別為5∶95、10∶90、20∶80、30∶70（V/V），通過比較回收率平均值和RSD，得到最優(yōu)洗脫溶劑比例。

（5）反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

葡萄酒樣品進(jìn)行檢測時(shí)，將熒光反應(yīng)時(shí)間設(shè)置為不同的時(shí)間范圍，分別為5 min、15 min、30 min、45 min、60 min，通過比較回收率平均值和RSD，得到最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.3.5 方法學(xué)研究

（1）線性范圍和線性方程

在最佳萃取及檢測條件下，得到峰面積（Y）與EC含量（X）之間的關(guān)系曲線，進(jìn)而得到線性方程和線性范圍。

（2）精密度實(shí)驗(yàn)

對同一葡萄酒樣品進(jìn)行6次重復(fù)測定，測定精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果的RSD。

（3）加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

檢測葡萄酒樣品中的EC含量，然后向葡萄酒中加入EC標(biāo)品后，再次檢測加標(biāo)后的EC含量。分別吸取EC標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 mg/L）0.01 mL、0.02 mL、0.04 mL置于10 mL容量瓶中，并用葡萄酒樣品定容，得到加標(biāo)量為50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L的葡萄酒樣品，計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)過程中每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行，并計(jì)算重復(fù)樣本的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。用SPSS 19.0進(jìn)行差異顯著性分析，采用Origin 2019b軟件進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 吸附時(shí)間的優(yōu)化

葡萄酒樣品進(jìn)行萃取時(shí)，研究不同吸附時(shí)間下EC的回收率，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 不同吸附時(shí)間對葡萄酒中氨基甲酸乙酯回收率的影響Table 2 Effect of different adsorption time on ethyl carbamate in wine

由表2可知，不同吸附時(shí)間下，其回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差大有不同，在吸附時(shí)間4 min時(shí)，氨基甲酸乙酯的平均回收率最低，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較大。隨著葡萄樣品萃取吸附時(shí)間的增加，回收率平均值趨于先增大后降低的趨勢，而相對標(biāo)準(zhǔn)偏差呈現(xiàn)相反的趨勢，當(dāng)吸附時(shí)間為10 min時(shí)，平均回收率為88.9%，接近100%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.32%，該吸附時(shí)間下提取EC效果最好。

2.1.2 淋洗溶劑的優(yōu)化

在葡萄酒樣品被吸附后，使用極性溶劑進(jìn)行淋洗，可以有效去除色素、糖分等雜質(zhì)，而氨基甲酸乙酯還可以有效的留在固相萃取柱上，試驗(yàn)中通過正己烷、乙酸乙酯、甲苯作為淋洗劑，以此確定最佳淋洗溶劑，結(jié)果見表3。

表3 不同淋洗溶劑對葡萄酒中氨基甲酸乙酯回收率的影響Table 3 Effect of different washing solvents on ethyl carbamate in wine

由表3可知，使用不同的溶劑進(jìn)行淋洗時(shí)，其回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差也不同，當(dāng)使用甲苯進(jìn)行淋洗時(shí)，EC不能夠很好的留在固相萃取柱上，故平均回收率最低，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.67%；使用乙酸乙酯淋洗時(shí)，其回收率平均值高于甲苯，為75.0%，且具有最大的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為11.07%；使用正己烷進(jìn)行淋洗時(shí)，發(fā)現(xiàn)EC物質(zhì)能夠很好的保留在固相萃取柱上，此時(shí)平均回收率為89.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.83%，正己烷提取EC效果最好。

2.1.3 洗脫溶劑的優(yōu)化

（1）洗脫溶劑種類的選擇

在確定淋洗溶劑后，根據(jù)EC的性質(zhì)，選取乙酸乙酯、乙醚、乙酸乙酯∶乙醚（5∶95，V/V）3種溶劑作為洗脫溶劑，結(jié)果見表4。

表4 不同洗脫溶劑對葡萄酒中氨基甲酸乙酯回收率的影響Table 4 Effect of different elution solvents on ethyl carbamate in wine

由表4可知，使用不同洗脫溶劑時(shí)對氨基甲酸乙酯的提取作用也不同，當(dāng)洗脫溶劑為乙醚時(shí)，平均回收率僅為58.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.29%，因此乙醚不適合作洗脫溶劑；使用乙酸乙酯時(shí)，其平均回收率為80.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.38%；使用乙酸乙酯∶乙醚（5∶95）溶液時(shí)，該洗脫溶劑對洗脫效果的影響最好，此時(shí)氨基甲酸乙酯回收率達(dá)到95.1%。

（2）洗脫溶劑比例的優(yōu)化

確定最優(yōu)的洗脫溶劑后，進(jìn)行洗脫比例的優(yōu)化，結(jié)果見表5。

表5 洗脫溶劑比例對葡萄酒中氨基甲酸乙酯回收率的影響Table 5 Effect of elution solvent ratio on ethyl carbamate in wine

由表5可知，確定最佳洗脫溶劑后，對不同洗脫溶劑比例進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)隨著乙酸乙酯與乙醚的體積比逐漸增加時(shí)，其平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差波動較大，說明洗脫溶劑比例對氨基甲酸乙酯的提取具有較大的影響；當(dāng)乙酸乙酯與乙醚的體積比達(dá)到30∶70時(shí)，平均回收率最低為72.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.52%，然而當(dāng)乙酸乙酯與乙醚的體積比為5∶95時(shí)，平均回收率為92.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.24%，其提取效果較佳。

從上述試驗(yàn)可以確定，采用固相萃取柱提取葡萄酒中的EC時(shí)，最佳固相萃取前處理：吸附時(shí)間為10 min，淋洗的弱極性溶劑為正己烷，洗脫溶劑為乙酸乙酯∶乙醚（5∶95，V/V）。

2.2 樣品測定過程中反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

在使用高效液相色譜測定樣品中氨基甲酸乙酯的變化時(shí)，對熒光反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，將其時(shí)間設(shè)定為5 min、15 min、30 min、45 min、60 min進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表6。

表6 反應(yīng)時(shí)間對葡萄酒中氨基甲酸乙酯回收率的影響Table 6 Effect of reaction time on ethyl carbamate in wine

由表6可知，不同的熒光反應(yīng)時(shí)間對葡萄酒中氨基甲酸乙酯的作用是不同的，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，葡萄酒樣品中氨基甲酸乙酯的平均回收率波動較大，而相對標(biāo)準(zhǔn)偏差呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為15 min時(shí)，其平均回收率最低為75.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.9%；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為60 min時(shí)其平均回收率與5 min的平均回收率接近，為了考慮實(shí)用性，選擇熒光反應(yīng)時(shí)間為5 min。

2.3 標(biāo)品及樣品的色譜圖研究

本實(shí)驗(yàn)流動相為乙腈-乙酸鈉，最佳固相萃取前處理以及檢測條件下得到的EC標(biāo)準(zhǔn)樣品和葡萄酒樣品的色譜圖見圖1。

圖1 氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（A）和葡萄酒樣品（B）的色譜圖Fig.1 Chromatogram of ethyl carbamate standard (A) and wine samples (B)

由圖1可知，在表1洗脫程序的試驗(yàn)下，獲得了良好的色譜峰，該洗脫程序?qū)C分離度高、峰對成性良好，樣品中的一些雜質(zhì)可以與EC分開，因此可以用于葡萄酒中EC的檢測。

2.4 線性范圍和線性方程

在最佳條件下建立峰面積（Y）與氨基甲酸乙酯含量（X）的關(guān)系曲線，得到其線性方程為Y=1 125.891 64X+7.292 33，相關(guān)系數(shù)R=0.999 1，線性范圍：10～1 000 μg/L。表明線性關(guān)系良好。

2.5 方法的精密度和檢出限

對同一葡萄酒樣品進(jìn)行6次的重復(fù)試驗(yàn)，測定其氨基甲酸乙酯含量并計(jì)算RSD，結(jié)果見表7。

表7 葡萄酒樣品中氨基甲酸乙酯測定方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 7 Results of precision experiments of the determination method of ethy carbamate in wine samples (n=6)

由表7可知，6次重復(fù)測定結(jié)果之間存在差異，但差異較小，針對6次重復(fù)做平均值，發(fā)現(xiàn)葡萄酒樣品中的EC平均含量為20.3 μg/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%，說明該檢測方法的重現(xiàn)性良好。設(shè)置進(jìn)樣量為20 μL，以3倍信噪比（S/N=3）作檢出限，得到檢出限5 μg/L。

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取相同的葡萄酒樣品，分別吸取質(zhì)量濃度為50 μg/L，100 μg/L，200 μg/L的氨基甲酸乙酯標(biāo)品，按照上述方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表8。

表8 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 8 Results of standard addition recovery rate experiments

通過在葡萄酒中添加三個(gè)水平的EC標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，葡萄酒樣品測定結(jié)果平均回收率為88.5%～92.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%～6.9%，平均回收率較高且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，說明該檢測方法可以用來進(jìn)行葡萄酒中氨基甲酸乙酯的而檢測。

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化葡萄酒中EC含量測定的高效液相-熒光檢測法。采用優(yōu)化后的方法，精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%～6.9%（n=6），加標(biāo)回收率在88.5%～92.8%，EC檢測限達(dá)到5 μg/L，操作快捷、精密度和回收率良好，容易掌握和進(jìn)一步推廣，可以將其用到葡萄酒樣品中EC的測定。