啤酒大麥、麥芽中多酚類化合物HPLC指紋圖譜分析技術(shù)研究

張晶晶，郝建秦，張曉蒙，石 俊，于佳俊，李 濤，陳 璐，王妍凌，楊 帆，3，盧灝澤，3，薛 潔*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015；3.西藏農(nóng)牧學(xué)院 食品科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000）

大麥（Hordeum vulgareL.）屬于禾本科植物，是世界第四大谷類作物，其在農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)中占有重要的地位，是人類最早馴化的古老培育作物之一[1]。大麥營養(yǎng)成分豐富，除含有碳水化合物、蛋白質(zhì)、膳食纖維外，還含有維生素、核黃素和胚芽維生素B，具有助消化、催乳、抗結(jié)腸炎、降血糖血脂等藥理性作用[2-5]。大麥經(jīng)過制麥后得到麥芽，麥芽作為啤酒工藝的主要原料，其品種屬性對啤酒品質(zhì)影響較大。

酚類化合物是植物體內(nèi)重要的次生代謝物質(zhì)，約占大麥干物質(zhì)的0.1%～0.3%，主要存在于麥皮、糊粉層和胚乳中，其在植物體的生長發(fā)育、抗病和抗脅迫等方面起到重要的調(diào)節(jié)作用[6]。有研究表明，大麥中酚類物質(zhì)含量與品種有關(guān)，也受生長條件的影響[7]。大麥酚類物質(zhì)含量雖少，卻對啤酒的色澤、泡沫、風(fēng)味和非生物穩(wěn)定性影響很大[8]。啤酒中約有70%～80%的多酚物質(zhì)來自麥芽[9]，其內(nèi)源性抗氧化力對啤酒的非生物穩(wěn)定性起著重要作用，有研究認(rèn)為酚類物質(zhì)在啤酒加工過程中會對美拉德反應(yīng)、脂質(zhì)氧化反應(yīng)或葡萄糖氧化反應(yīng)所產(chǎn)生的自由基有抑制作用[10]，也有研究認(rèn)為，啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性與多酚物質(zhì)的抗氧化活性有關(guān)聯(lián)，因此，酒體中存在適量的多酚能夠提高酒體的風(fēng)味穩(wěn)定性[11-13]。

指紋圖譜技術(shù)是一種綜合的、可量化的鑒定手段，廣泛應(yīng)用于中藥領(lǐng)域。它是建立在物質(zhì)化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，主要用于評價(jià)中藥材、中藥制劑半成品質(zhì)量的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性以及食品評價(jià)、種子檢測和鑒定，也常用于分析酒中揮發(fā)性成分特征，尤其在中藥材品質(zhì)控制及質(zhì)量特征鑒定方面表現(xiàn)出了穩(wěn)定性好、特征性強(qiáng)的優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用[14-17]。不同品種的大麥和酒花原料中的酚類化合物對啤酒的質(zhì)量影響較大，與啤酒產(chǎn)品品質(zhì)特點(diǎn)具有較強(qiáng)的相關(guān)性[18-19]，因此，人們對啤酒大麥中酚類化合物的關(guān)注度越來越高。而由于大麥麥芽多酚類物質(zhì)與中藥中的黃酮類物質(zhì)在結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性，并對大麥、麥芽及啤酒品質(zhì)的相關(guān)性較強(qiáng)[11，20-21]，本研究采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法研究不同品種啤酒大麥及麥芽樣品中多酚類物質(zhì)的組成，基于此，構(gòu)建HPLC指紋圖譜，并通過指紋圖譜相似度分析、共有峰聚類分析（clustering analysis，CA）和主成分分析（principal component analysis，PCA）研究各品種大麥、麥芽之間的品質(zhì)差異，以期為大麥、麥芽及啤酒品質(zhì)控制、生產(chǎn)過程質(zhì)量監(jiān)控提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

10個(gè)進(jìn)口和8個(gè)國產(chǎn)啤酒大麥品種及其相對應(yīng)的麥芽樣品信息詳情見表1。

表1 大麥及麥芽樣品信息Table 1 Information of barley and malt samples

1.1.2 試劑

甲醇、乙腈（均為色譜純）、無水乙醚、11%甲醇硫酸溶液、福林酚、無水碳酸鈉（均為分析純）：北京化工廠；沒食子酸、兒茶素、香草酸、安息香酸、丁香酸、原兒茶酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、香豆素、槲皮素、山奈酚、蘆丁、表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥99%）：上海源葉生物科技有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DLFU-W23050盤式粉碎機(jī)：德國Buhler universal公司；1260VWD高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；LR10高速冷凍離心機(jī)：北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司；KQ-100DE數(shù)控超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；UV1780紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；HH電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；HY-5型回旋式振蕩器：常州榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精確稱取沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、安息香酸、香草酸、咖啡酸、表兒茶素、丁香酸、阿魏酸、芥子酸、香豆素、槲皮素、山奈酚、蘆丁各20 mg，用甲醇溶解并定容至200 mL；取1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用甲醇定容至25 mL作為混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，貯存于-4 ℃冰箱內(nèi)，待用。

1.3.2 多酚類物質(zhì)的提取

將干燥的大麥及麥芽樣品機(jī)械粉碎，過60目篩，參考ZHAO H F等[22-23]的方法提取多酚類物質(zhì)。

1.3.3 多酚類物質(zhì)的檢測

參照文獻(xiàn)[23]中的HPLC法測定混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液和大麥、麥芽樣品中的多酚類物質(zhì)種類及含量。

HPLC條件：C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動相A：5%甲醇+0.1%甲酸水溶液，流動相B：5%乙腈+0.1%甲酸甲醇溶液；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃；檢測波長280 nm。梯度洗脫程序：0～15 min，74%A；15～30 min，60%A；30～50 min，35%A；50～60 min，20%A；60～66 min，100%A[22]。

定性、定量：根據(jù)保留時(shí)間定性，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.3.4 共有峰的確認(rèn)

將18個(gè)不同品種的大麥、麥芽的HPLC色譜圖分別導(dǎo)入到2012版中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件中，設(shè)置某一樣品圖譜為參照圖譜（S1），確定樣品中共有的成分為共有峰，根據(jù)各個(gè)成分相對保留時(shí)間的一致性進(jìn)行峰匹配，以多點(diǎn)校正消除各圖譜的時(shí)間誤差，自動匹配后得到共有峰，并以中位數(shù)法生成對照指紋圖譜（R）。

1.3.5 相似度評價(jià)[24-25]

將所得的18個(gè)不同品種的大麥、麥芽樣品的多酚色譜圖譜分成大麥和麥芽兩組，分別導(dǎo)入國家藥典委員會2012版中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件，得到18個(gè)大麥樣品的色譜疊加圖和18個(gè)麥芽樣品的色譜疊加圖，并計(jì)算大麥、麥芽共有峰的相似度，以判斷大麥、麥芽質(zhì)量的穩(wěn)定性和差異性。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

基于18個(gè)大麥、麥芽品種樣品所有共有峰的樣本數(shù)據(jù)，運(yùn)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行主成分降維，得到相關(guān)矩陣的方差貢獻(xiàn)率以及主成分的得分；再進(jìn)行系統(tǒng)聚類，以得到其樹狀圖。運(yùn)用Origin12.0對主成分得分作三維散點(diǎn)圖，來區(qū)分樣品間的差異性；用2012版中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件計(jì)算樣品間的相似性。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥及麥芽多酚類化合物含量

大麥及麥芽中多酚類化合物含量的測定結(jié)果分別見表2和表3。由表2和表3可知，混合標(biāo)準(zhǔn)品中的14種化合物在大麥、麥芽中均有檢出，只是品種間含量和種類會有差異。在大麥樣品中多酚類物質(zhì)的含量在0～149.14 mg/kg之間，進(jìn)口大麥的多酚類物質(zhì)含量在0～149.14 mg/kg之間，國產(chǎn)大麥的多酚類物質(zhì)含量在0～18.16 mg/kg之間，進(jìn)口大麥的多酚類物質(zhì)顯著高于國產(chǎn)大麥，在18個(gè)大麥品種中，沒食子酸、香草酸、安息香酸、原兒茶酸、咖啡酸、阿魏酸、槲皮素、山奈酚、蘆丁的含量相對較高。

表3 不同品種麥芽多酚類物質(zhì)含量測定結(jié)果Table 3 Determination results of polyphenols contents of different varieties of malt mg/kg

大麥在發(fā)芽后多酚類物質(zhì)的含量和種類顯著增加，麥芽中多酚類物質(zhì)的含量在0～570.45 mg/kg之間，其中進(jìn)口麥芽的多酚類物質(zhì)含量在0～570.45 mg/kg之間，國產(chǎn)麥芽的多酚類物質(zhì)含量在0～153.62 mg/kg之間，進(jìn)口麥芽的多酚類物質(zhì)含量普遍高于國產(chǎn)麥芽。大麥發(fā)芽后一些品種增加了芥子酸、香豆素、表兒茶素。在18個(gè)不同品種的麥芽中，香草酸、安息香酸、丁香酸、原兒茶酸、咖啡酸、阿魏酸、槲皮素、山奈酚、蘆丁含量相對較高，且表兒茶素幾乎只存在于國產(chǎn)大麥麥芽中。

2.2 指紋圖譜的建立

2.2.1 大麥及麥芽樣品多酚類物質(zhì)指紋圖譜的建立

混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高效液相色譜圖見圖1，采用中位數(shù)法對各色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正并自動匹配生成對照指紋圖譜（R）以及18種大麥、麥芽的HPLC疊加指紋圖譜，結(jié)果見圖2。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of mixed standard solution

圖2 18種大麥（a）及麥芽（b）樣品的HPLC疊加指紋圖譜Fig.2 HPLC overlay fingerprints of 18 kinds of barley (a) and malt (b) samples

2.2.2 大麥及麥芽樣品多酚類物質(zhì)指紋圖譜共有峰的確認(rèn)

（1）大麥樣品多酚類物質(zhì)指紋圖譜共有峰的確認(rèn)

從18種大麥樣品中共檢測出14種多酚類物質(zhì)，對18種大麥樣品的多酚類物質(zhì)指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)匹配，確認(rèn)出9個(gè)共有峰，通過與混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖比對確定9個(gè)共有峰分別為沒食子酸、香草酸、安息香酸、原兒茶酸、咖啡酸、槲皮素、山奈酚、蘆丁、芥子酸。

（2）麥芽樣品多酚類物質(zhì)指紋圖譜共有峰的確認(rèn)

從18種麥芽樣品中共檢測出14種多酚類物質(zhì)，對18種麥芽樣品的多酚類物質(zhì)指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)匹配，確認(rèn)出9個(gè)共有峰，通過與混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖比對確定9個(gè)共有峰分別為香草酸、安息香酸、丁香酸、原兒茶酸、咖啡酸、阿魏酸、槲皮素、山奈酚、蘆丁。

2.2.3 大麥及麥芽樣品多酚類物質(zhì)的相似度評價(jià)

對18種大麥樣品多酚類物質(zhì)圖譜的9個(gè)共有峰與對照圖譜（R）進(jìn)行相似度計(jì)算，結(jié)果見表4。由表4可知，18種大麥樣品共有的多酚類化合物圖譜與對照圖譜（R）的相似度在0.911～0.989之間，其中進(jìn)口大麥B1、B2、B5、B7圖譜與對照圖譜（R）的相似度在0.938～0.946之間，其余進(jìn)口大麥圖譜與對照圖譜（R）的的相似度＞0.96，而國產(chǎn)大麥的圖譜與對照圖譜（R）的相似度在0.911～0.937之間，普遍＜0.94，相似度均低于進(jìn)口大麥。對18種麥芽樣品多酚類物質(zhì)圖譜的9個(gè)共有峰與對照圖譜（R）進(jìn)行相似度計(jì)算，結(jié)果見表5。由表5可知，18種麥芽樣品共有多酚類物質(zhì)圖譜與對照圖譜（R）的相似度在0.892～0.981之間，其中進(jìn)口麥芽圖譜與對照圖譜（R）的相似度在0.892～0.967之間，進(jìn)口麥芽樣品M1、M10圖譜與對照圖譜（R）的相似度＞0.96，國產(chǎn)麥芽圖譜與對照圖譜（R）的相似度普遍＞0.95，說明國產(chǎn)麥芽之間的相似性較高，且進(jìn)口麥芽M1、M10與國產(chǎn)麥芽相似度較為接近。

表4 18種大麥樣品的HPLC指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果Table 4 Similarity calculation results of HPLC fingerprint of 18 barley samples

表5 18種麥芽樣品的HPLC指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果Table 5 Similarity calculation results of HPLC fingerprint of 18 malt samples

2.3 大麥及麥芽樣品多酚類物質(zhì)的聚類分析[26]

為了區(qū)別不同品種大麥或麥芽的差異，將18種大麥和18種麥芽樣品中的14種多酚類物質(zhì)的峰面積導(dǎo)入SPSS 23.0軟件，采用組間連接法以歐氏平方距離為測度進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。

圖3 18種大麥（a）和麥芽（b）樣品中多酚類物質(zhì)的聚類分析結(jié)果Fig.3 Cluster analysis results of polyphenols in 18 kinds of barley (a)and malt (b) samples

由圖3a可知，當(dāng)判別距離＜5時(shí)，18個(gè)大麥樣品中，國產(chǎn)大麥樣品（B11～B18）全部聚為一類，個(gè)別進(jìn)口大麥樣品（B2）與國產(chǎn)大麥樣品也聚為一類，而其他的進(jìn)口大麥品種B1和B10聚為一類，B3和B4聚為一類，B5～B9聚為一類，因此，通過聚類分析能將國產(chǎn)大麥與進(jìn)口大麥進(jìn)行有效區(qū)分。由圖3b可知，當(dāng)判別距離＜5時(shí)，18個(gè)麥芽樣品中，國產(chǎn)大麥麥芽樣品（M11～M18）聚為一類，但有3個(gè)進(jìn)口大麥麥芽樣品（M2～M4）與國產(chǎn)大麥麥芽樣品聚為一類，而其他進(jìn)口大麥麥芽樣品則單獨(dú)聚類，即M1和M10聚為一類，M5和M7聚為一類，M8、M6、M9均單獨(dú)分離出來，因此，通過聚類分析方法能將部分國產(chǎn)大麥麥芽與進(jìn)口大麥麥芽樣品進(jìn)行基本區(qū)分。

2.4 大麥及麥芽樣品多酚類物質(zhì)的主成分分析[27]

2.4.1 大麥樣品多酚類物質(zhì)主成分分析

對18種大麥樣品中的14種多酚類物質(zhì)的峰面積進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表6。

由表6可知，前3個(gè)因子的特征根＞1，其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到81.689%，故選取這3個(gè)因子分別作為主成分1、2、3。各個(gè)原始變量在主成分上的載荷矩陣見表7。

表6 大麥樣品中多酚類物質(zhì)主成分分析結(jié)果Table 6 Principal component analysis results of polyphenols in barley samples

由表7可知，主成分1主要體現(xiàn)了沒食子酸、兒茶素、阿魏酸、芥子酸、香豆素、槲皮素和蘆丁等特性指標(biāo)，其中沒食子酸、阿魏酸、香豆素和蘆丁對主成分1起到了較高的正載荷，說明主成分1受這幾種成分影響較大。主成分2主要體現(xiàn)了香草酸、原兒茶酸、咖啡酸等指標(biāo)，且這幾種化學(xué)物質(zhì)均對主成分2有較高的正載荷，其中香草酸的載荷值最高，證明主成分2受香草酸的影響較為明顯。主成分3主要體現(xiàn)了安息香酸和丁香酸的特性指標(biāo)，且都對主成分3起到了較高的正載荷。不同大麥樣品的各主成分得分值，結(jié)果見表8，大麥多酚類物質(zhì)主成分得分圖見圖4。

圖4 大麥樣品中多酚類物質(zhì)主成分得分圖Fig.4 Principal component scores plot of polyphenols in barley samples

表7 大麥樣品多酚類物質(zhì)主成分載荷矩陣Table 7 Principal component load matrix of polyphenols in barley samples

表8 大麥樣品中多酚類物質(zhì)各主成分的得分Table 8 Principal components scores of polyphenols in barley samples

續(xù)表

由圖4可知，大麥樣品B1和B10較為接近，大麥樣品B3和B4較為接近，大麥樣品B5～B9分布距離較近，大麥樣品B2和B11～B18分布較為緊密，這與聚類分析的結(jié)果一致。

2.4.2 麥芽樣品多酚類物質(zhì)主成分分析

對18種麥芽樣品中的14種多酚類物質(zhì)的峰面積進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表9。

表9 麥芽樣品中多酚類物質(zhì)主成分分析結(jié)果Table 9 Principal component analysis results of polyphenols in malt samples

由表9可知，前3個(gè)因子的特征根＞1，其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到79.431%，故選取這3個(gè)因子分別作為主成分1、2、3。各個(gè)原始變量在主成分上的載荷矩陣見表10。

表10 麥芽樣品中多酚類物質(zhì)主成分載荷矩陣Table 10 Principal component load matrix of polyphenols in malt samples

由表10可知，主成分1沒食子酸、阿魏酸、香豆素、蘆丁的載荷值較高，說明主成分1受這幾種成分影響較大。主成分2香草酸、原兒茶酸、咖啡酸有較高的正載荷。主成分3主要體現(xiàn)了安息香酸、丁香酸的特性指標(biāo)貢獻(xiàn)率。不同大麥麥芽樣品的各主成分得分值見表11，得分圖見圖5。

圖5 麥芽樣品中多酚類物質(zhì)主成分得分圖Fig.5 Main principal component scores plot of polyphenols in malt samples

表11 麥芽樣品中多酚類物質(zhì)各主成分的得分Table 11 Each main component scores of polyphenols in malt samples

由圖5可知，麥芽樣品M5與M7分布較為接近，麥芽樣品M1與M10分布較為接近，麥芽樣品M6、M8與M9分布距離較遠(yuǎn)，麥芽樣品M2～M4與M11～M18分布較為密集，這與聚類分析的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究采用高效液相色譜法對國內(nèi)外18個(gè)啤酒大麥及相對應(yīng)的麥芽樣品中的多酚類化合物進(jìn)行檢測，構(gòu)建指紋圖譜，相似度分析結(jié)果表明，進(jìn)口大麥樣品的相似度（0.938～0.989）高于國產(chǎn)大麥樣品（0.911～0.937），而進(jìn)口大麥麥芽的相似度（0.892～0.981）普遍低于國產(chǎn)大麥麥芽的相似度（0.956～0.967）；CA（判別距離＜5）結(jié)果和PCA結(jié)果一致，8個(gè)國產(chǎn)大麥和1個(gè)進(jìn)口大麥樣品B2聚為一類，8個(gè)國產(chǎn)麥芽和3個(gè)進(jìn)口麥芽樣品M2、M3、M4聚為一類，說明通過大麥、麥芽多酚類物質(zhì)的HPLC指紋圖譜技術(shù)能基本區(qū)分國產(chǎn)和進(jìn)口大麥品質(zhì)的差異。