羅氟司特通過mTOR/ULK1/Atg13通路改善支氣管哮喘小鼠氣道炎癥反應的研究

沈文婷, 秦建品, 許 詣

(湖北文理學院附屬醫院/湖北省襄陽市中心醫院 兒科, 湖北 襄陽, 441021)

支氣管哮喘(BA)是以喘息、胸悶、呼吸困難等為主要臨床癥狀的慢性氣道炎癥性呼吸系統疾病[1-2]。支氣管收縮、氣道神經控制、過敏、細胞因子及炎癥反應、免疫及先天易感性是BA的主要發病機制[3]。家族遺傳性BA患者支氣管組織中發現自噬激活激酶1(ULK1)、自噬相關蛋白5(Atg5)、自噬相關蛋白(Beclin1)等表達異常改變[4], 預示BA的發生發展可能與自噬水平異常關系密切，這也可能為BA的治療提供新思路。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是自噬的負性調控因子，可磷酸化調控ULK1的不同位點，影響自噬相關蛋白13(Atg13)與FIP200復合物的形成，調控自噬啟動及發生[5]。但mTOR/ULK1/Atg13通路介導的自噬反應在BA發生發展中的調控機制的相關研究較少。羅氟司特為一種新型、高度選擇性磷酸二酯酶4抑制劑，體內外研究[6]證實其具有抗炎、免疫調節及改善氣道重塑作用，被批準應用于慢性阻塞性肺疾病的治療，但其在BA中的應用還處于探索階段。本研究建立BA小鼠模型，給予羅氟司特藥物干預治療，并從mTOR/ULK1/Atg13自噬調控方面，探究其對氣道炎癥的影響機制，以期為羅氟司特在BA領域的應用提供理論依據。

1 資料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物: SPF級健康雄性C57BL/6J小鼠，體質量20～22 g, 6～7周齡，購自于北京醫科大學實驗動物科學部[SCXK(京) 2018-0003], 所有小鼠于動物房中飼養(12 h光照及12 h黑暗交替照明，溫度25 ℃, 濕度50%)。本試驗經倫理委員會批準(ICAU-202004032651), 試驗動物符合3R原則。

1.1.2 主要試劑及儀器: 羅氟司特(貨號YJ-23180R, 上海雅吉生物科技有限公司); 雷帕霉素(貨號R8140-25, 北京索萊寶科技有限公司); 自噬抑制劑(3-甲基腺嘌呤, 3MA)(貨號YT66820, 北京伊塔生物科技有限公司); γ-干擾素(INF-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號ZN2638-ADL、ZN2764-XRL，北京百奧萊博科技有限公司); 磷酸化mTOR(p-mTOR)、白細胞介素-33(IL-33)、Atg13、mTOR、ULK1特定位點Ser757蛋白(ULK1 Ser757)、自噬標記蛋白微管相關蛋白輕鏈3B(LC3B)、Beclin1、B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、IL-33, 黏液高分泌性標志蛋白(黏蛋白MUC5AC)抗體(美國abcam公司); 磷酸化Atg13(p-Atg13)(貨號13007, 美國Signalway Antibody公司)、磷酸化ULK1 Ser757蛋白(p-ULKl Ser757)[貨號6888T, 賽信通(上海)生物試劑有限公司)]；動物肺功能儀(型號FinePointeTMPFT, 美國Buxco公司)等。

1.2 方法

1.2.1 小鼠BA模型建立及分組給藥: 取小鼠，參照文獻[7]用卵清蛋白(OVA)50 μg于1、5、8 d腹腔注射致敏，并于22～28 d用1% OVA生理鹽水溶液霧化吸入建立小鼠BA模型，若小鼠出現呼吸喘促、哮鳴音、搔鼻、打噴嚏、口鼻處有白色黏性分泌物增多現象，表明造模成功。共造模成功50只小鼠，隨機分為模型組、羅氟司特組、自噬激活劑-mTOR抑制劑(雷帕霉素)組，羅氟司特+雷帕霉素組，自噬抑制劑(3MA)組，每組10只。另取10只正常小鼠，于相同時間以相同方法給予等量生理鹽水，作為正常對照組。各組小鼠均于造模成功后開始給藥，羅氟司特參照文獻[8]設置劑量1.0 mg/kg(生理鹽水稀釋至0.10 mg/mL, 按10 mL/kg體積灌胃給藥, 1次/d); 雷帕霉素(1.0 mg/kg)及3MA (10 mg/kg)參照文獻[9-10]設置劑量并經腹腔注射給藥, 2次/周; 羅氟司特+雷帕霉素組灌胃給予羅氟司特(1.0 mg/kg)的同時，腹腔注射雷帕霉素溶液(1.0 mg/kg); 模型組及正常對照組灌胃給予10 mL/kg生理鹽水，各組小鼠連續給藥4周。

1.2.2 小鼠肺功能檢測: 給藥期間，觀察小鼠呼吸及皮毛狀態、口鼻等部位分泌物形成情況，咳嗽(或氣喘)等肺系疾病特異性癥狀變化。給藥結束后，用4%戊巴比妥鈉溶液1 mL/kg腹腔注射麻醉小鼠后，于頸部正中處剪開皮膚，剝離周圍組織分離氣管，行氣管插管術，用動物肺功能測定儀測定小鼠吸氣阻力、呼氣阻力、肺通氣順應性等肺功能變化。

1.2.3 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸粒細胞及中性粒細胞計數及炎癥因子檢測: 檢測完小鼠肺功能后，麻醉、暴露氣管，結扎主支氣管，輸液針氣管插管并固定，經氣管注入4 ℃含酚紅緩沖液5 mL, 輕輕按摩胸部20～30 s后，回收BALF, 共3次(回收率>90%), 將回收后的BALF于4 ℃、1 500轉/min(5 cm有效離心半徑)離心10 min, 取上清液, 1 mL磷酸緩沖溶液重懸細胞后，取10 μL于光學顯微鏡下進行細胞總數計數[(4個大格細胞總數/4)×104/mL]。取100 μL細胞重懸液，快速迪夫染色后，封片置于20倍光學顯微鏡下觀察并分類計數，計數公式=(χ/200)×細胞總數,χ=5個視野中細胞所占百分比相加再除以5。取上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測INF-γ、TNF-α水平。

1.2.4 透射電鏡檢測及標本采集: 處死小鼠，沿支氣管束走行方向，剪下約0.3 cm×0.3 cm組織塊，浸入2.5%戊二醛后，送入電鏡室檢查自噬泡形成情況。取左肺組織，置于-80 ℃保存，取完整右肺組織迅速置于4%多聚甲醛中固定24 h，常規透明、浸蠟、包埋后，切成5 μm切片。

1.2.5 小鼠肺組織蘇木精-伊紅(HE)、過碘酸-雪夫(PAS)染色及TUNEL染色觀察: 取右肺相同部位切片，按HE及PAS染色試劑盒說明書方法進行染色、封片后，置于光學顯微鏡下觀察組織病理變化及杯狀細胞化生狀況。取肺組織切片，按TUNEL染色試劑盒說明書方法染色、封片后，在光學顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，用Image-pro plus軟件系統檢測棕黃色凋亡細胞數目，細胞凋亡率=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.2.6 蛋白質印跡法(Western blot)檢測肺組織Atg13、p-Atg13、mTOR、p-mTOR、ULK1 Ser757、p-ULKl Ser757、LC3B、Beclin1、Bcl-2、IL-33、MUC5AC蛋白相對表達水平。取1.2.4中冰凍肺組織, 4 ℃解凍后，冰上均漿、離心提取蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測蛋白總濃度后，取100 μg蛋白上樣，并進行電泳及轉膜反應，加入一抗[Atg13、p-Atg13、mTOR、p-mTOR、ULK1 Ser757、p-ULKl Ser757、LC3B、Beclin1、Bcl-2、IL-33、MUC5AC, 1∶800; β-actin(內參), 1∶1 000]抗體, 4 ℃搖床孵育過夜，加入辣根過氧化物酶(HRP)羊抗兔二抗(1∶2 000), 37 ℃搖床孵育2 h, 增強化學發光法顯色，以化學發光儀觀察條帶并拍照，以Image-J軟件分析各組蛋白相對表達。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 羅氟司特對小鼠一般行為的影響

正常對照組小鼠呼吸均勻正常，口唇鼻等部位無異常分泌物出現。模型組及羅氟司特+雷帕霉素組小鼠呼吸急促，搔鼻、打噴嚏，口鼻處白色黏性分泌物增多。雷帕霉素組小鼠呼吸減慢、俯伏不動、口鼻處白色黏性分泌物增多現象進一步加重。羅氟司特組及3MA組小鼠呼吸及節律漸復平穩、均勻，口鼻處白色黏性分泌物減少，搔鼻、打噴嚏現象減少或消失。

2.2 羅氟司特對小鼠肺功能的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠吸氣阻力、呼氣阻力升高，肺通氣順應性降低，差異有統計學意義(P<0.05), 預示肺功能下降; 與模型組相比，羅氟司特組及3MA組小鼠吸氣阻力、呼氣阻力降低，肺通氣順應性升高，差異有統計學意義(P<0.05), 肺功能改善；與模型組相比，雷帕霉素組肺功能進一步降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與羅氟司特組比較，羅氟司特+雷帕霉素組小鼠吸氣阻力、呼氣阻力升高，肺通氣順應性降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠肺功能比較

2.3 羅氟司特對小鼠BALF中性粒細胞及嗜酸粒細胞數目及炎性因子 INF-γ、TNF-α水平的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠BALF中性粒細胞、嗜酸粒細胞數目增多, INF-γ、TNF-α水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組相比，羅氟司特組及3MA組小鼠中性粒細胞、嗜酸粒細胞數目減少, INF-γ、TNF-α水平降低，差異有統計學意義(P<0.05); 與模型組比較，雷帕霉素組中性粒細胞、嗜酸粒細胞數目增多，INF-γ、TNF-α水平升高(P<0.05)。與羅氟司特組相比，羅氟司特+雷帕霉素組小鼠中性粒細胞、嗜酸粒細胞數目增多, INF-γ、TNF-α水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 小鼠BALF中性粒細胞、嗜酸粒細胞數目及INF-γ、TNF-α水平比較

2.4 羅氟司特對小鼠肺組織結構變化及杯狀細胞化生的影響

正常對照組小鼠肺組織結構完整，染色均勻; HE染色顯示模型組及羅氟司特+雷帕霉素組小鼠氣道、血管周圍、肺間質等部位炎癥細胞浸潤、支氣管管壁增厚等病理損傷嚴重; PAS染色可見氣道上皮有大量呈紫紅色的杯狀細胞增生，黏液分泌增多。羅氟司特組及3MA組小鼠肺組織炎癥細胞浸潤、支氣管壁增厚、杯狀細胞化生等病理損傷緩解; 雷帕霉素組顯示肺組織炎癥細胞浸潤、支氣管壁增厚、杯狀細胞化生等病理損傷進一步加重。見圖1。

A: 正常對照組HE染色; B: 正常對照組PAS染色; C: 模型組HE染色; D: 模型組PAS染色; E: 羅氟司特組HE染色; F: 羅氟司特組PAS染色; G: 3MA組HE染色; H: 3MA組PAS染色; I: 雷帕霉素組HE染色; J: 雷帕霉素組PAS染色; K: 羅氟司特+雷帕霉素組HE染色; L: 羅氟司特+雷帕霉素組PAS染色。圖1 各組小鼠肺組織HE染色及PAS染色圖(放大200倍)

2.5 羅氟司特對小鼠肺組織氣道上皮細胞自噬及凋亡的影響

正常對照組小鼠肺組織支氣管上皮細胞結構正常，上皮細胞胞漿中幾乎未見自噬泡形成及凋亡。電鏡觀察可見模型組小鼠支氣管上皮細胞中，雙層膜結構的細胞自噬泡聚集較多，部分自噬泡中可見吞噬物形成，TUNEL染色可見肺組織支氣管上皮細胞棕黃色顆粒物質沉積增多，相較正常對照組凋亡率增高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組相比，羅氟司特組及3MA組小鼠肺組織支氣管上皮細胞自噬泡形成減少，上皮細胞凋亡率降低，差異有統計學意義(P<0.05); 與模型組相比，雷帕霉素組小鼠肺組織支氣管上皮細胞自噬泡形成進一步增加，細胞凋亡率進一步升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與羅氟司特組相比，羅氟司特+雷帕霉素組小鼠肺組織支氣管上皮細胞自噬泡形成增多，上皮細胞凋亡率增高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 各組細胞凋亡率比較

A: 正常對照組電鏡圖; B: 正常對照組TUNEL染色圖; C: 模型組電鏡圖; D: 模型組TUNEL染色圖; E: 羅氟司特組電鏡圖; F: 羅氟司特組TUNEL染色圖; G: 3MA組電鏡圖; H: 3MA組TUNEL染色圖; I: 雷帕霉素組電鏡圖; J: 雷帕霉素組TUNEL染色圖; K: 羅氟司特+雷帕霉素組電鏡圖; L: 羅氟司特+雷帕霉素組TUNEL染色圖。圖2 各組小鼠肺組織支氣管上皮細胞電鏡圖(放大50 000倍)及TUNEL染色圖(放大400倍)

2.6 羅氟司特對小鼠mTOR、p-mTOR、Atg13、p-Atg13、ULK1 Ser757、p-ULKl Ser757、LC3B蛋白表達的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠肺組織p-mTOR/mTOR、p-Atg13/Atg13、p-ULKl Ser757/ULK1 Ser757表達降低, LC3B表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組相比，羅氟司特組及3MA組小鼠肺組織p-mTOR/mTOR、p-Atg13/Atg13、p-ULKl Ser757/ULK1 Ser757表達升高，LC3B表達降低，雷帕霉素組小鼠p-mTOR/mTOR、p-Atg13/Atg13、p-ULKl Ser757/ULK1 Ser757表達進一步降低, LC3B表達進一步升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與羅氟司特組相比，羅氟司特+雷帕霉素組小鼠p-mTOR/mTOR、p-Atg13/Atg13、p-ULKl Ser757/ULK1 Ser757表達降低, LC3B表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3、表4。

A: 正常對照組; B: 模型組; C: 羅氟司特組; D: 3MA組; E: 雷帕霉素組; F: 羅氟司特+雷帕霉素組。圖3 各組小鼠肺組織中mTOR、p-mTOR、Atg13、p-Atg13、ULK1 Ser757、p-ULKl Ser757、LC3B蛋白質印跡圖

表4 各組小鼠肺組織mTOR、p-mTOR、Atg13、p-Atg13、ULK1 Ser757、p-ULKl Ser757、LC3B蛋白表達

2.7 羅氟司特對小鼠Bcl-2、Beclin1、IL-33、MUC5AC蛋白表達的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠肺組織Bcl-2蛋白表達降低, Beclin1、IL-33、MUC5AC蛋白表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組相比，羅氟司特組及3MA組小鼠肺組織Bcl-2蛋白表達升高, Beclin1、IL-33、MUC5AC表達降低，雷帕霉素組小鼠Bcl-2蛋白表達進一步降低, Beclin1、IL-33、MUC5AC蛋白表達進一步升高，差異有統計學意義(P<0.05); 與羅氟司特組相比，羅氟司特+雷帕霉素組小鼠織Bcl-2蛋白表達降低, Beclin1、IL-33、MUC5AC表達升高(P<0.05)。見表5、圖4。

表5 各組小鼠肺組織Bcl-2、Beclin1、IL-33、MUC5AC蛋白表達比較

A: 正常對照組; B: 模型組; C: 羅氟司特組; D: 3MA組; E: 雷帕霉素組; F: 羅氟司特+雷帕霉素組。圖4 各組小鼠肺組織中Bcl-2、Beclin1、IL-33、MUC5AC蛋白質印跡圖

3 討 論

氣道慢性炎癥、氣道高黏液分泌可阻塞氣流，導致BA患者呼吸困難[11]。MUC5AC是氣道黏液高分泌標志蛋白，其表達升高，可反映BA氣道黏液高反應狀態[12]。本研究建立小鼠BA模型后，發現小鼠氣道中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞等炎癥細胞聚集增多，支氣管肺組織炎癥浸潤及杯狀細胞化生增多, MUC5AC表達升高，肺功能下降嚴重，提示小鼠BA造模成功。吸入性糖皮質激素對大部分急性加重期BA患者治療效果不甚顯著，尋找特異性有效的治療藥物，一直是臨床研究的熱點之一[13]。臨床報道[14]發現，羅氟司特對急性加重期BA患者氣道重塑及肺功能損傷的改善效果優于糖皮質激素藥物布地奈德，預示其在BA領域的應用具有廣闊前景。本研究結果顯示，羅氟司特干預組可顯著緩解BA小鼠肺通氣下降，抑制MUC5AC表達，并對支氣管肺組織炎癥浸潤及杯狀細胞化生有明顯緩解作用，證實了羅氟司特在BA方面的應用價值，但其具體分子生物學機制還需進一步探究。

細胞自噬與BA的發生發展關系密切，并逐漸成為BA機制研究的熱點之一[15]。研究[16-17]發現，哮喘患者及模型大鼠支氣管組織中存在自噬激活現象，并認為LC3B表達與BA氣道上皮細胞自噬有關[18]。本研究結果顯示，模型組大鼠氣道上皮細胞自噬泡數量及氣道組織中自噬標記蛋白LC3B、Beclin1表達均升高的同時，氣道上皮細胞凋亡率也顯著增加，用自噬抑制劑3MA抑制自噬后，氣道上皮細胞凋亡率顯著降低，小鼠BA癥狀也顯著緩解。羅氟司特干預組出現與3MA組相同的自噬及氣道上皮細胞凋亡率降低現象，提示羅氟司特治療BA的作用可能是通過抑制自噬、緩解BA氣道上皮細胞凋亡而實現的。

mTOR/ULK1/Atg13通路是參與自噬、炎癥、凋亡調節的關鍵通路。研究[19]發現, mTOR磷酸化活化水平增加，可促進Atg13-FIP200及ULK1 Ser757位點磷酸化，來阻斷自噬復合物的形成，從而抑制自噬小體形成，阻斷自噬啟動; 另外mTOR也可直接調控抗凋亡因子Bcl-2表達，使Bcl-2能通過競爭性調節BH3受體域作用，抑制Beclin1依賴的自噬形成[20]。研究[21]發現，炎癥信號因子IL-33是刺激氣道炎癥應激反應、促進氣道上皮細胞凋亡及自噬標記蛋白LC3B異常表達升高的主要原因。本研究結果顯示，模型組小鼠肺組織中mTOR/ULKl Ser757/Atg13通路磷酸化水平、Bcl-2抗凋亡蛋白異常降低，而Beclin1、LC3B自噬蛋白及炎癥因子IL-33蛋白異常升高，提示mTOR/ULK1/Atg13通路磷酸化活化水平降低，可能參與BA小鼠肺組織炎癥、自噬、凋亡過程。雷帕霉素可抑制p-mTOR水平, ULK1/Atg13通路磷酸化活化水平降低的同時，小鼠氣道上皮細胞炎癥、自噬、凋亡反應進一步加重, BA小鼠病理癥狀也進一步加重，但這與金華良等[22]報道的雷帕霉素促進自噬，緩解BA病理癥狀的機制相反，推測可能是雷帕霉素用量不一致及疾病程度不一致有關。羅氟司特與3MA干預組顯示, mTOR/ULK1/Atg13通路磷酸化活化水平增高，肺組織炎癥、自噬、凋亡反應降低。但雷帕霉素在促進自噬，加重BA癥狀的同時，還可減弱羅氟司特發揮的促進mTOR/ULK1/Atg13通路磷酸化活化、阻斷自噬、抑制肺組織炎癥及氣道上皮細胞凋亡等作用。

綜上所述，羅氟司特可通過促進mTOR/ULK1/Atg13通路磷酸化活化，阻斷自噬，抑制肺組織炎癥及氣道上皮細胞凋亡，緩解BA病理癥狀。這為羅氟司特在BA領域的開發應用提供了一定參考。但BA自噬調控機制復雜，涉及多條途徑、調控網絡，羅氟司特調控自噬、緩解BA病理癥狀的其他調控機制還有待進一步研究。