芳香烴受體mRNA、白細胞介素22在2型糖尿病中的作用研究

劉艷秋, 范海迪, 孫 健, 薛 蓮, 孟 月, 林 寧

(1. 江蘇省淮安市第一人民醫院分院 檢驗科, 江蘇 淮安, 223002;2. 南京醫科大學附屬淮安第一醫院 檢驗科, 江蘇 淮安, 223300)

2型糖尿病(T2DM)的特點是胰島β細胞功能失調或者胰島素抵抗，傳統的危險因素有高血壓、肥胖和血脂異常等，慢性炎性反應也是其發病機制之一[1-2]。作為新的輔助型T淋巴細胞(Th細胞)亞群, Th22細胞主要分泌白細胞介素22 (IL-22)。Th22細胞與IL-22在惡性腫瘤、自身免疫性疾病及多種炎癥疾病中發揮著重要作用[3]。蔣茂芹等[4]研究報道，胃癌組織中IL-22、白細胞介素22結合蛋白(IL-22BP)呈高表達，且二者表達水平與胃癌的侵襲和轉移有關，或可協同促進胃癌的發生發展。在高糖導致的胰島素抵抗和糖尿病并發癥中，炎性介質起重要的作用[5]。研究[6-7]報道，當發生糖尿病和胰島素抵抗時, c-Jun氨基末端激酶(JNK)和IKKβ/NF-κB 會激活，引起白細胞介素(IL)-6、IL-18、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-1β等炎癥因子的大量釋放。大量的炎癥因子會造成胰腺中β細胞破壞以及胰島素抵抗的發生，因此炎癥因子被認為是導致糖尿病并發癥的主要因素[8-9]。本研究對2型糖尿病患者血液中Th22細胞轉錄因子芳香烴受體(AhR) mRNA水平及其功能分子IL-22進行檢測，并分析其相關因素，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年7月—2020年7月在淮安市第一人民醫院分院就診的患者為研究對象并分為3組。① T2DM組納入48例，患者均符合2010年中國糖尿病協會發布的糖尿病防治指南的診斷標準; 男25例，女23例，年齡37～78歲，平均(57.24±10.83)歲; 空腹血糖(FPG)≥ 7.0 mmol/L、餐后2 h血糖(2 hPG)≥ 11.1 mmol/L為糖尿病診斷標準。② 糖尿病前期組納入49例，男24例，女25例，年齡35～75歲，平均(54.86±9.01)歲; 患者疾病類型分為空腹血糖受損(IGF)和糖耐量異常(IGT), IGF的診斷標準為FPG為6.1～6.9 mmol/L且 2 hPG<7.8 mmol/L, IGT的診斷標準為FPG<7.0 mmol/L且2 hPG為7.8～11.1 mmol/L。③ 選取同期在本院體檢的健康者50例為對照組，男25例，女25例，年齡34～77歲，平均(55.12±10.99)歲。排除抗谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)、抗胰島素抗體(IAA)、抗胰島細胞抗體(ICA)陽性的成人隱匿性自身免疫性糖尿病(LADA)和1型糖尿病患者，排除合并糖尿病并發癥、感染、腫瘤等患者。

1.2 研究方法

記錄各組患者的身高、體質量，計算體質量指數(BMI); 應用Bio-Rad血紅蛋白測試系統及離子交換高壓液相法(HPLC)檢測受試者全血中的糖化血紅蛋白(HbA1c)水平。采用日立7600型自動生化分析儀測定空腹血清FPG、甘油三酯(TG)、膽固醇(CHO)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、餐后血糖(PPG)和超敏C反應蛋白(hs-CRP)含量。血清空腹胰島素(FINS)水平采用深圳新產業MAGLUMIX8型全自動化學發光儀檢測。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定各組血清IL-22水平，血清IL-22檢測試劑盒購自美國Rapidbio(RB)公司。采集外周靜脈血5 mL于EDTA抗凝管中，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法及淋巴細胞分離液分離出單個核細胞(PBMCs)，利用Trizol法提取 PBMCs總RNA。

采用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法測定全血單個核細胞中AhRmRNA水平的表達，實時熒光定量PCR儀為美國NanoDrop公司ND-1000型，使用美國invitrogen公司RNA提取試劑盒，采用日本Takara公司生產的逆轉錄試劑盒及PCR定量反應試劑盒，測定試劑包括總RNA提取試劑Trizol、第1鏈cDNA反轉錄試劑盒和SYBR熒光定量試劑盒等。引物序列由上海生工生物技術有限公司設計并合成，序列如下:AhRmRNA的上游引物為5′-ACTCCACTTCAGCCACCATC-3′, 下游引物為 5′-ATGGGACTCGGCACAATAAA-3′, 擴增片段204 bp。內參采用β-actin: 上游引物為5′-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3′, 下游引物為5′-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3′, 擴增片段262 bp。

PCR實驗結束后，設置閾值和基線，得出Ct值; Ct值是熱循環儀檢測到反應體系中熒光信號到達設定閾值所經歷循環數, ΔCt實驗組=(Ct實驗組目的基因-Ct實驗組內參基因), ΔCt對照組= (Ct對照組目的基因-Ct對照組內參基因), 2-ΔCt即為各組目的基因的相對表達含量。PCR擴增產物的特異性通過溶解曲線分析，以此排除其他副反應產物(例如二聚體)的影響。計算各組目的基因AhRmRNA的相對表達含量。

1.3 統計學處理

采用SPSS 23.0統計軟件對數據進行分析和處理。計量資料以均值±標準差表示，多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，各指標間相關性分析采用Pearson相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組一般資料比較

糖尿病前期組、T2DM組FBG、TG、PPG、HbA1c、hs-CRP均高于對照組, T2DM組HDL-C低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01); T2DM組FBG、TG、PPG、HbA1c高于糖尿病前期組, HDL-C低于糖尿病前期組，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 各組一般資料比較

2.2 各組FINS、IL-22、AhR mRNA相對表達量比較

目的基因AhRmRNA與內參基因β-actin的溶解曲線均呈現單峰，證明引物的特異性良好，見圖1。糖尿病前期組FINS、血清IL-22高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01); 糖尿病前期組AhRmRNA相對表達含量較對照組升高，但差異無統計學意義(P>0.05); T2DM組FINS、血清IL-22、AhRmRNA相對表達含量均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01); T2DM組FINS、IL-22、AhRmRNA相對表達含量高于糖尿病前期組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

圖1 AhR mRNA擴增曲線及溶解曲線

表2 各組FINS、IL-22、AhR mRNA相對表達量比較

2.3 Pearson相關性分析

AhRmRNA、IL-22與年齡、CHO、TG、LDL-C、BMI均無相關性(P>0.05), 與FBG、FINS、PPG、HbA1c、hs-CRP呈正相關(P<0.05或P<0.01), 見表3。

表3 AhR mRNA、IL-22與臨床指標的相關性

3 討 論

T2DM作為代謝性疾病之一，其發病率逐年上升，造成了嚴重的經濟負擔。因此，預防和治療糖尿病意義重大。有關研究[10-12]表明，在存在胰島素抵抗的糖尿病患者中, Th22細胞的數量及外周血IL-22 水平明顯升高。有學者[13-14]研究發現, Th22細胞及其相關因子IL-22可促進糖尿病患者肥胖及脂肪組織炎癥的發展，并參與胰島素抵抗及加重血管壁損傷。唐雪嬌等[15]研究發現，在高糖誘導心肌肥大的過程中，心肌細胞AhR的表達增加可能參與維持正常糖代謝過程，并且高糖環境能激活AhR轉入細胞核內，從而上調細胞色素P450家族成員1A1(CYP1A1)的表達，以促進活性氧(ROS)的生成，這可能是導致高糖誘導心肌肥大的重要機制之一。AhR是一種被配體激活的轉錄因子，其在細胞生長、分化、免疫、凋亡等方面發揮功能，尤其在調控藥物方面發揮非常重要的功能[16-17]。由于Th22細胞亞群主要效應細胞因子IL-22 的受體主要分布的部位是外周組織，因此被認為是直接向周圍組織傳遞炎癥效應信號的重要細胞亞群。BAKER N A等[18]、BILJES D等[19]實驗證明AhR的表達異常將導致糖脂代謝失衡，說明AhR在機體調節糖脂代謝過程中起關鍵作用, AhR可能是糖尿病發病的關鍵因素。

研究[20-22]顯示外周血Th22細胞除了特異性分泌IL-22以外，也可分泌IL-17、TNF-α等炎癥因子，在自身免疫性疾病、炎癥性疾病、惡性腫瘤患者血液中明顯升高，并與病情嚴重程度及預后相關。IL-22在T2DM中的確切作用和機制尚不清楚，可能通過抑制氧化應激和內質網應激以及保護胰島B細胞等調節葡萄糖代謝，也可能誘導免疫細胞分泌炎癥因子而加劇慢性炎癥反應[23]。HERDER C等[24]采用多因素調查顯示IL-22水平與糖尿病的不同代謝狀態不是獨立相關的，血清IL-22水平也不是T2DM發病風險的獨立相關因素, IL-22基因缺失并不會加重高脂飲食誘導的肥胖和胰島素抵抗。FABBRINI E等[11]認為IL-22可減輕胰島素介導的抑制肝細胞葡萄糖生成作用，可以干擾肝臟的糖代謝，通過增加肝臟葡萄糖的產生而升高血糖。IL-22在2型糖尿病中的確切作用機制尚不完全明確，有可能通過抑制氧化應激和內質網應激以及保護胰島B細胞來調節葡萄糖的代謝能力。本研究結果顯示, T2DM組血清IL-22的表達水平高于糖尿病前期組及對照組，糖尿病前期組IL-22高于對照組，提示IL-22在糖尿病的發病機制中起著重要的作用;AhRmRNA、IL-22水平與FBG、FINS、PPG、HbA1c、hs-CRP呈正相關,AhRmRNA、IL-22可能與糖尿病的發生和發展有關。

綜上所述，通過檢測AhRmRNA、IL-22水平對T2DM患者進行病情評估和預后判斷具有一定的臨床意義,AhRmRNA、IL-22或可成為糖尿病治療研究的新靶標。