腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中程序性死亡受體配體1的表達(dá)及其與乳腺癌不良預(yù)后的關(guān)系

楊 菊, 李小靜, 劉秀萍, 2, 楊 珂, 曹 麗, 舒維清

(1. 復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院 病理科, 上海, 200240;2. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)系, 上海, 200032)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，是女性癌癥的第二大死亡原因[1]。腫瘤微環(huán)境(TME)是腫瘤研究的熱點，其主要由癌細(xì)胞及大量浸潤性巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞組成[2]。乳腺癌細(xì)胞可招募腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs), 腫瘤組織中高密度的TAMs浸潤與乳腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)[3]。程序性死亡受體配體1(PD-L1)在乳腺癌中表達(dá)的研究較多，但其預(yù)后意義尚未完全清楚。原發(fā)性乳腺癌中癌細(xì)胞PD-L1的表達(dá)與高危臨床病理參數(shù)和不良預(yù)后相關(guān)[4]。癌細(xì)胞上高表達(dá)PD-L1的患者在進(jìn)行新輔助化療后獲得病理完全緩解的可能性增加，而癌細(xì)胞低表達(dá)PD-L1的患者具有更好的總體生存率(OS)[5]。乳腺癌中關(guān)于PD-L1的研究主要集中于癌細(xì)胞或腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)中PD-L1的表達(dá)[6]。TAMs是TME中PD-L1表達(dá)的主要來源，且TAMs上PD-L1的表達(dá)比癌細(xì)胞上的更穩(wěn)定[7]。目前，有關(guān)巨噬細(xì)胞中PD-L1表達(dá)的研究較少。本研究檢測PD-L1在TAMs中的表達(dá)及其與臨床病理的相關(guān)性，探討其可能的機(jī)制，為乳腺癌的治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

使用腫瘤微環(huán)境單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)庫(TISCH)獲取乳腺癌腫瘤組織單細(xì)胞水平轉(zhuǎn)錄組學(xué)信息。79個數(shù)據(jù)集中的4個數(shù)據(jù)集預(yù)測了TAMs中編碼PD-L1的RNA(命名為CD274)的表達(dá)(http://tisch.comp-genomics.org/search-gene/)。 所有參數(shù)均設(shè)置為默認(rèn)值。

1.2 患者隊列

本研究由醫(yī)院研究倫理委員會批準(zhǔn)，并根據(jù)方案2019MHZ032進(jìn)行。收集2014年1月—2019年12月復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院病理科165例浸潤性乳腺癌患者組織及相關(guān)臨床病理資料。165例患者中，82例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移, 83例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移; 年齡29～88歲，中位年齡59歲。福爾馬林固定的石蠟包埋組織切成4 μm的切片。根據(jù)世界衛(wèi)生組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，由病理醫(yī)生進(jìn)行診斷。

1.3 多色免疫熒光組織染色及抗體

所有組織均用福爾馬林固定，常規(guī)技術(shù)包埋于石蠟中。組織切片(4 μm)經(jīng)脫蠟、返水，并在0.1 mol/L檸檬酸鈉(pH 6.0)中進(jìn)行微波抗原修復(fù)，染色前用5%的羊血清封閉20 min。將載玻片上滴加2種抗體[CD68(KP1, ab955, Abcam, 1∶25)]和PD-L1(SP142, CST, 1∶250)的混合物(2種抗體來自不同的種屬)，在4 ℃冰箱中孵育過夜；然后在磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌載玻片，于暗室中與2種二抗的混合物[異硫氰酸熒光素(FITC)或Tesas紅結(jié)合]37 ℃溫箱中孵育1 h; 然后將載玻片在PBS中洗滌，并用Hoechst(ab228551, Abcam, 1∶1 000)孵育30 s進(jìn)行復(fù)染，使細(xì)胞核著色；然后在自來水中短暫沖洗載玻片，封片。立即使用熒光顯微鏡(蔡司)觀察并拍照。

1.4 免疫熒光染色的評估

熒光顯微鏡低倍鏡下觀察切片中CD68+PD-L1+細(xì)胞密集區(qū)域，從每個切片中選擇5個高倍視野(放大400倍)計數(shù)，取平均值即為該組織切片中PD-L1+TAMs浸潤數(shù)量。取PD-L1+TAMs計數(shù)的中位數(shù)，平均值大于中位數(shù)即為PD-L1高表達(dá)，否則為低表達(dá)。

1.5 患者的生存預(yù)后

通過門診或電話定期回訪患者。總生存期定義為患者確診至任何原因?qū)е滤劳龅臅r間。隨訪時間截至2021年12月或死亡。OS測量了所有病例的死亡率，用于預(yù)后分析。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)和試劑

THP-1單核細(xì)胞在添加10% 胎牛血清(FBS)(Gibco)和0.05 mmol/L β-聚體(Invitrogen)的RPMI 1640(Invitrogen)中培養(yǎng)。MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞在完全RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細(xì)胞系每2周檢查1次支原體，使用前均為陰性。

佛波酯(PMA)購自Sigma Aldrich。白細(xì)胞介素(IL)-4和IL-13購自PeproTech。THP-1單核細(xì)胞經(jīng)100 nmol/L PMA孵育72 h后，在RPMI培養(yǎng)基中孵育24 h分化為巨噬細(xì)胞。添加20 ng/mL IL-4和20 ng/mL IL-13孵育獲得M2型巨噬細(xì)胞。在共培養(yǎng)實驗中, THP-1單核細(xì)胞以100 000個細(xì)胞/孔的密度接種在24個Transwell板(康寧)中。巨噬細(xì)胞與MCF-7/MDA-MB-231細(xì)胞共培養(yǎng)24 h。

1.7 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)

使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)Western blot方案。收集M2型巨噬細(xì)胞，提取蛋白，用二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行蛋白定量。取30 mg總蛋白/泳道裝入凝膠中。使用抗PD-L1和vinculin(Sigma)的抗體來檢測蛋白質(zhì)，并用過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔二抗(Abcam)孵育。使用ImageJ軟件進(jìn)行密度分析以量化條帶面積。

1.8 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)

RNA提取和實時定量PCR, 使用Trizol試劑提取總RNA，使用SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis for RT-PCR (Invitrogen, 18080-051)試劑盒合成cDNA，按照說明書使用PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix (Tran，AQ601)試劑盒進(jìn)行RT-PCR。熱循環(huán)條件如下: 95 ℃初始激活30 s, 95℃進(jìn)行40次循環(huán)10 s, 60 ℃ 20 s, 72 ℃ 30 s。實驗分復(fù)孔進(jìn)行。以β-actin為參照，使用2-△△Ct方法計算PD-L1基因組轉(zhuǎn)錄本的相對表達(dá)水平，正向和反向引物見表1。

表1 引物序列

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

所有分析均使用SPSS 18.0進(jìn)行。PD-L1表達(dá)與患者臨床病理特征之間的相關(guān)性采用χ2檢驗或Fisher′s精確檢驗進(jìn)行評估。Kaplan-Meier方法用于估計OS, 對數(shù)秩檢驗用于比較亞組。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 原發(fā)性乳腺癌組織和轉(zhuǎn)移癌中PD-L1的表達(dá)

通過TISCH進(jìn)行scRNA-seq分析，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中巨噬細(xì)胞PD-L1的表達(dá)高于原發(fā)性乳腺癌組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖1。

A、B: 原發(fā)性乳腺癌; C、D: 轉(zhuǎn)移性乳腺癌; E: 原發(fā)性乳腺癌(BRCA_GSE114727、BRCA_GSE138536)、轉(zhuǎn)移性乳腺癌(BRCA_GSE110686、BRCA_GSE143423)圖1 原發(fā)性乳腺癌組織和轉(zhuǎn)移瘤中巨噬細(xì)胞PD-L1的表達(dá)

2.2 乳腺癌TAMs中PD-L1的表達(dá)

在乳腺癌組織樣本的間質(zhì)和癌細(xì)胞中均可觀察到PD-L1和CD68的表達(dá)，其表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，呈顆粒狀(圖2)。為了檢測乳腺癌TAMs(CD68陽性細(xì)胞)中PD-L1的表達(dá)，從每個切片選取5個高密度區(qū)域計算PD-L1+CD68+(圖1中黃色部分所示)細(xì)胞的數(shù)量, 165例乳腺癌患者的中位數(shù)為(19.24±10.01)/高倍視野。為了研究TAM中PD-L1表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系，根據(jù)PD-L1+CD68+細(xì)胞的中位數(shù)將乳腺癌患者分為PD-L1高表達(dá)組和PD-L1低表達(dá)組(圖2)。

比例尺為10 μm, 計算至少3次獨立試驗平均值。圖2 乳腺癌中PD-L1+(綠色)、CD68+(紅色)和PD-L1+CD68+(黃色)的免疫熒光染色。

2.3 患者的臨床病理特征及其與TAMs中PD-L1表達(dá)的相關(guān)性

165例乳腺癌患者均為女性, 122例患者年齡≥50歲, 43例年齡<50歲; 72例患者腫瘤≤2 cm, 78例患者腫瘤>2 ～5 cm, 15例患者腫瘤>5 cm。其中83例患者無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移, 43例患者1～3個淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性, 20例患者4～9個淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性, 19例有≥10個淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性。診斷時，6例患者處于Ⅰ期, 62例患者處于Ⅱ期, 97例患者處于Ⅲ期或Ⅳ期。PD-L1+TAMs浸潤密度與組織學(xué)分級相關(guān)(P<0.05), PD-L1+TAMs浸潤與年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分子亞型和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無相關(guān)性(P>0.05)。見表2。

表2 患者臨床病理特征及其與TAMs中PD-L1表達(dá)的關(guān)系

2.4 乳腺癌患者PD-L1+TAMs浸潤密度與生存時間呈負(fù)相關(guān)

隨訪期間12例患者死于乳腺癌，最短生存時間為1個月。采用Kaplan-Meier生存分析, PD-L1+TAMs高表達(dá)和低表達(dá)患者的平均生存時間分別為88.70和78.58個月。PD-L1+TAMs高表達(dá)和低表達(dá)患者的生存曲線不同。PD-L1+TAMs的高表達(dá)與較差的OS相關(guān)(P=0.014)。見圖3。

圖3 TAMs 中PD-L1的表達(dá)對乳腺癌預(yù)后的影響

2.5 巨噬細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)

通過與PMA、IL-4和IL-13孵育將THP-1單核細(xì)胞誘導(dǎo)為M2型巨噬細(xì)胞，并檢測其中PD-L1的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示與MCF-7或MDA-MB-231細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后, M2型巨噬細(xì)胞中PD-L1蛋白表達(dá)水平增加(P<0.05或P<0.001)。見圖4。在與MCF-7或MDA-MB-231細(xì)胞共同培養(yǎng)的M2型巨噬細(xì)胞中,PD-L1mRNA豐度更高(P<0.05或P<0.001), 見圖5。

A: M2型巨噬細(xì)胞與MCF-7細(xì)胞系共培養(yǎng)24 h; B: M2型巨噬細(xì)胞與MDA-MB-231細(xì)胞系共培養(yǎng)24 h。與M2型巨噬細(xì)胞中PD-L1表達(dá)比較, *P<0.05, ***P<0.001。圖4 M2型巨噬細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)。

A: M2型巨噬細(xì)胞與MCF-7細(xì)胞系共培養(yǎng)24 h; B: M2型巨噬細(xì)胞與MDA-MB-231細(xì)胞系共培養(yǎng)24 h。與M2型巨噬細(xì)胞中PD-L1 mRNA表達(dá)比較, *P<0.05, ***P<0.001。圖5 M2型巨噬細(xì)胞PD-L1 mRNA表達(dá)水平。

3 討 論

乳腺癌是一種嚴(yán)重影響女性身心健康的惡性腫瘤，目前主要治療方法為手術(shù)切除、局部放療和化療[1]。M2型TAMs與多種癌癥的生長、遷移和侵襲有關(guān)。同時, M2型TAMs也可能通過表達(dá)免疫檢查點蛋白PD-L1/程序性死亡受體配體2(PD-L2)和CD80/CD86促進(jìn)免疫監(jiān)視腫瘤逃逸，使TAMs成為免疫檢查點抑制劑程序性死亡受體-1(PD-1)的直接靶點[8-9]。抑制M2型TAM中IL-10/STAT3/NF-κB信號通路，可阻斷免疫抑制性TME的發(fā)展[8]。目前，多種針對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的治療策略已經(jīng)被開發(fā)[9-13]。

本研究結(jié)果顯示，原發(fā)性乳腺癌TAMs中PD-L1的表達(dá)與組織學(xué)分級顯著正相關(guān); 原發(fā)性乳腺癌中PD-L1+TAMs的浸潤密度與患者的生存時間呈負(fù)相關(guān); 與腫瘤組織TAMs中PD-L1低表達(dá)患者相比, PD-L1高表達(dá)患者總體生存率更差。TME在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用受到廣泛關(guān)注[14]。目前, TME被認(rèn)為是診斷治療的靶點或預(yù)后的生物標(biāo)志物。在免疫系統(tǒng)中, TAMs是癌癥免疫抑制的主要驅(qū)動因素[15]。研究[4]表明，在乳腺癌患者中, TAMs浸潤率高的患者OS較差。

乳腺癌中PD-L1的表達(dá)與高TIL水平和存在不良預(yù)后因素呈正相關(guān)[16]。腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞中PD-L1陽性表達(dá)與較差的OS顯著相關(guān)。本研究中, PD-L1+TAMs浸潤數(shù)量越多, OS越差。TISCH的scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示，與原發(fā)性乳腺癌相比，轉(zhuǎn)移時巨噬細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)顯著上調(diào)。乳腺腫瘤組織PD-L1+TAMs浸潤密度與患者生存時間呈負(fù)相關(guān)，高密度組的總體生存率顯著降低。提示PD-L1+TAMs的高度浸潤性是乳腺癌免疫逃逸的一個重要因素，這與單細(xì)胞分析[17]的結(jié)果一致。 巨噬細(xì)胞具有顯著可塑性，使其能夠有效地適應(yīng)環(huán)境變化，并改變表型和生理學(xué)特性[15]。巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性最初被描述為2大類: M1(經(jīng)典激活)和M2(交替激活)，大多數(shù)TAMs更傾向于M2型巨噬細(xì)胞[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，極化后M2型巨噬細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)顯著高于THP-1單核細(xì)胞。本研究將M2型巨噬細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞系MCF-7或MDA-MB-231共培養(yǎng)24 h, TAMs中PD-L1mRNA及PD-L1蛋白表達(dá)水平增高。相關(guān)研究[20-21]顯示, 4T1細(xì)胞共培養(yǎng)后，巨噬細(xì)胞PD-L1水平增加; 口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的原代腫瘤細(xì)胞可通過IL-10刺激單核細(xì)胞上的PD-L1表達(dá)，與本研究結(jié)果一致。既往研究[6]表明, PD-L1表達(dá)主要通過I型和II型干擾素信號途徑調(diào)節(jié)。一項研究[22]表明，TNF-α是一種細(xì)胞因子，可導(dǎo)致單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)上調(diào)。TAMs中PD-L1表達(dá)的調(diào)節(jié)方式可能與腫瘤細(xì)胞自身不同。故PD-L1的表達(dá)是TAMs的一個重要特征，其調(diào)控理論有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，乳腺癌組織TAMs中PD-L1的表達(dá)是相關(guān)不良臨床結(jié)果的獨立預(yù)后因素。TAMs中PD-L1陽性表達(dá)與組織學(xué)分級和不良預(yù)后顯著正相關(guān)，可能在腫瘤進(jìn)展中起重要作用。靶向TAMs中的PD-L1可能為乳腺癌治療提供一種新的治療方法。但本研究存在一定局限性，本研究未明確調(diào)節(jié)TAMs中PD-L1表達(dá)的潛在信號通路，其次僅探討了M2型TAMs中PD-L1的表達(dá)，以及未證實TAMs中PD-L1的表達(dá)在抗PD1/PD-L1治療中的預(yù)測價值，仍需進(jìn)一步研究闡明。