葉酸受體陽性循環腫瘤細胞在卵巢癌輔助診斷和療效監測中的應用價值

汪 瑩, 申復進, 鄭紅云, 馮 丹

(武漢大學人民醫院, 1. 婦產科, 2. 檢驗科, 湖北 武漢, 430060)

卵巢癌是臨床常見的婦科惡性腫瘤疾病，發病率和病死率分別居婦科惡性腫瘤的第3位和第1位[1]。卵巢癌患者早期臨床癥狀和體征不明顯，超過75%的患者確診時已發展至晚期，其5年生存率低于25%[2]。糖類抗原125(CA125)是卵巢癌常用生物標志物，但其也可在子宮內膜異位癥、肺癌[3]等疾病患者中高表達，用作篩查工具缺乏特異性。人附睪蛋白4(HE4)在卵巢癌中呈高表達，在卵巢良性腫瘤或非卵巢癌中呈低表達或不表達，相較于CA125具有更高的特異性[4]。臨床醫師常用HE4聯合CA125檢測結果對卵巢癌進行診斷，其敏感性高于單一檢測結果，但診斷早期卵巢癌仍有不足[5]。因此，臨床亟需探尋新的生物標志物用于卵巢癌的篩查及初步診斷。近年來，外周血循環腫瘤細胞(CTC)被逐步應用于卵巢癌的診斷[6]、療效監測[7]和預后判斷等方面，不僅檢測方便，而且無創。葉酸受體(FR)是一種糖基磷脂酰肌醇偶聯蛋白，在健康人血液細胞中一般不表達，一旦發生上皮源性細胞癌變，FR表達量則顯著上升，尤其是在卵巢癌、肺癌等上皮來源的腫瘤組織中[8]。本研究探討葉酸受體陽性循環腫瘤細胞(FR+-CTC)在卵巢癌輔助診斷和治療監測中的臨床應用價值，現報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

回顧性選取武漢大學人民醫院2019年5月—2020年12月診治的31例卵巢癌患者納入卵巢癌組，年齡21～76歲，平均(54.17±7.58)歲。納入標準[9]: ① 經術后病理確診卵巢癌，符合卵巢癌診斷標準者; ② 術前未接受放療或化療等抗腫瘤治療者; ③ 治療前后均檢測FR+-CTC者; ④ 病例資料完整者。排除標準: 合并其他系統惡性腫瘤、重要臟器疾病者。同時選取59例在婦科門診檢測FR+-CTC的健康體檢者納入對照組，年齡20～84歲，平均(59.44±12.98)歲，均無腫瘤相關病史，無心、腦、肝等重要臟器器質性疾病。2組一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05), 具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器: FR+-CTC檢測試劑盒(格諾思博生物科技有限公司), CA125檢測試劑盒(Siments公司，批號015183), HE4檢測試劑盒(瑞典康乃格公司，批號37356001), 羅氏cobas e 801全自動化學發光免疫分析儀，德國西門子ADVIA Centuar XP全自動化學發光免疫分析儀。

1.2.2 標本采集: 分別抽取卵巢癌患者(治療前后)和對照組體檢者靜脈血4 mL于6 mL真空采血管(加有EDTA 抗凝劑)內，上下顛倒7～8次, 4～10 ℃暫存，并于24 h內進行檢測。

1.2.3 FR+-CTC檢測: 應用FR+-CTC檢測試劑盒檢測FR+-CTC水平。① 取全血標本3 mL置于15 mL離心管中，加入12 mL細胞裂解液裂解紅細胞，離心10 min, 棄上清。② 加入重懸細胞后，加入免疫磁珠A液、B液負向富集去除樣本中白細胞(CD45+)。③ 加入10 μL探針標記液，室溫孵育40 min; 加入900 μL細胞洗滌液洗滌后，離心收集細胞。④ 行聚合酶鏈反應(PCR)擴增及熒光檢測，計算各校準品CT值。參照多中心受試者臨床試驗結果，將每3 mL血中FR+-CTC≥8.7葉酸單位(FU)作為FR+-CTC陽性的判定標準。

1.2.4 CA125、HE4檢測: 采用化學發光雙抗體夾心法檢測CA125、HE4水平，將CA125>30.2 U/mL作為CA125陽性的判定標準。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 不同臨床特征卵巢癌患者的FR+-CTC檢測結果

不同年齡、不同分期、不同組織分型、有無遠處轉移的卵巢癌患者FR+-CTC陽性率比較，差異均無統計學意義(P>0.05), 見表1。

表1 不同臨床特征卵巢癌患者的FR+-CTC檢測結果比較[n(%)]

2.2 對照組與卵巢癌組外周血FR+-CTC含量比較

對照組體檢者(n=59)外周血(3 mL) FR+-CTC含量為2.71～8.35 FU, 平均6.35(4.87, 7.44) FU; 卵巢癌組患者(n=31)治療前外周血(3 mL)FR+-CTC含量為5.53～31.26 FU，平均11.78(7.36，17.31) FU; 卵巢癌組患者(n=24)治療后外周血(3 mL) FR+-CTC含量為3.36～25.02 FU, 平均10.84(6.67, 20.95) FU。卵巢癌組患者治療前后外周血FR+-CTC含量均高于對照組體檢者，差異有統計學意義(P<0.05); 治療后，卵巢癌組患者外周血FR+-CTC含量低于治療前，但差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 FR+-CTC與CA125、HE4對卵巢癌的診斷結果比較

31例卵巢癌患者均檢測FR+-CTC水平，且其中19例患者檢測CA125水平, 21例患者檢測HE4水平。外周血FR+-CTC診斷卵巢癌的靈敏度為87.10%, 高于血清腫瘤標志物CA125、HE4的靈敏度63.16%、52.38%, 差異有統計學意義(χ2=3.934、7.669,P=0.047、0.006), 故FR+-CTC可作為卵巢癌的早期獨立預測因子，見表2。Pearson相關性分析結果顯示, FR+-CTC與CA125、HE4均無相關性(r=0.280、0.384,P>0.05)。

表2 FR+-CTC與糖類抗原125、人附睪蛋白4對卵巢癌的診斷結果比較

2.4 FR+-CTC陽性、CA125陽性卵巢癌患者分期情況比較

FR+-CTC陽性(每3 mL外周血中FR+-CTC≥8.7 FU)卵巢癌患者中, Ⅲ～Ⅳ期者占比70.37%, 高于Ⅰ～Ⅱ期者占比， 差異有統計學意義(P<0.05); CA125陽性(CA125>30.2 U/mL)卵巢癌患者中, Ⅲ～Ⅳ期者占比91.67%, 高于Ⅰ～Ⅱ期者占比，差異有統計學意義(P<0.05);與CA125陽性患者中Ⅰ～Ⅱ期者占比相比, FR+-CTC陽性患者中Ⅰ～Ⅱ期者占比更高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 FR+-CTC陽性、糖類抗原125陽性卵巢癌患者分期情況比較[n(%)]

3 討 論

卵巢癌是常見的女性生殖系統惡性腫瘤之一，病死率高居婦科惡性腫瘤的首位，嚴重危害女性生命安全與健康[10]。全球每年約有24萬名女性被診斷出卵巢癌，整體5年生存率低于45%[11]。卵巢癌起病隱匿，早期缺乏明顯癥狀，多數患者確診時已發展至晚期[12]，出現腹水、腹脹、消瘦等癥狀，預后不良。早期診斷可提高卵巢癌患者的生存率，改善不良預后，但僅15%的卵巢癌患者能在早期確診[13]。

CTC是指從惡性腫瘤原發部位或轉移部位脫落，通過血管或淋巴系統進入血液循環的細胞[14], 可通過無創方式進行檢測。目前, CTC已被廣泛應用于肺癌[15]、乳腺癌[16]、結直腸癌[17]等惡性腫瘤的早期診斷、療效監測和預后判斷中。雖然卵巢癌患者的CTC水平較其他實體瘤患者低，但近年來CTC也逐漸被應用于卵巢癌中，且有研究[18]指出CTC與卵巢癌治療效果和預后具有相關性。KIM H等[19]檢測了13例卵巢癌患者多個時點的血樣，并評估CTC、CA125水平與疾病病程的相關性，發現手術、化療后CTC計數下降，且CTC相較于CA125敏感性、陽性預測值更高，與治療反應、復發的相關性更好。CHEBOUTI I等[20]對卵巢癌患者初診及化療后的配對血液樣本的CTC水平和患者生存期進行分析后發現，化療后CTC高水平與生存期縮短具有相關性。由此推測, CTC在卵巢癌患者療效監測、預后判斷方面具有重要的臨床參考價值，但目前將FR+-CTC應用于卵巢癌早期輔助診斷的研究仍較少，故有必要進一步深入探討。

李曉利等[21]分析CTC陽性率與卵巢癌患者臨床病理特征之間的關系發現, CTC陽性率與年齡、病理分型無相關性，但與淋巴結轉移、國際婦產科聯盟(FIGO)分期具有相關性。本研究結果顯示，不同年齡、不同分期、不同組織分型、有無遠處轉移的卵巢癌患者FR+-CTC陽性率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，與李曉利等[21]結論不符，這可能由FIGO分期、腫瘤遠處轉移的劃分標準不同而引起。劉春華等[22]研究表明，卵巢癌患者組CTC檢測陽性率為73.33%，與健康志愿者組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。本研究中，卵巢癌組患者治療前后外周血FR+-CTC含量均高于對照組健康體檢者，差異有統計學意義(P<0.05), 且對照組外周血FR+-CTC含量均低于陽性界定值，提示CTC檢測結果能夠輔助鑒別卵巢癌。BANYS-PALUCHOWSKI M等[23]分析卵巢癌患者化療前和化療3、6個周期后CTC水平發現，化療3個周期后患者CTC陽性率下降至4.8%, 化療6個周期后則未檢出CTC陽性者。隨著化療周期的延長，卵巢癌患者CTC陽性率呈下降趨勢，因此FR+-CTC能夠反映患者的治療效果，可用于卵巢癌的療效監測。本研究結果顯示，卵巢癌組患者治療后的外周血FR+-CTC含量低于治療前，但差異無統計學意義(P>0.05), 這可能與本研究樣本量過少有關。

CA125是上皮細胞表達的糖蛋白[24], 在正常組織及良性病變組織中呈低表達，在卵巢癌中呈高表達，常被應用于卵巢癌的臨床診斷和療效監測。HE4是小分子分泌性蛋白[25], 在卵巢癌中呈高表達，可用于卵巢癌的復發診斷與預測。相關研究[26]報道, HE4聯合CA125預測卵巢癌復發的靈敏度、特異度均高于單獨應用HE4。PEARL M L等[27]研究發現，對于Ⅰ、Ⅱ期卵巢癌而言，CTC診斷的特異度與陽性預測值均高于CA125，且CTC與臨床因素的一致性強于CA125。ZHANG X H等[28]檢測14例早期(ⅠA～ⅠB期)卵巢癌患者的CTC、CA125水平發現, CTC診斷早期卵巢癌的效果相較于CA125更突出。本研究發現, FR+-CTC診斷卵巢癌的靈敏度為87.10%, 顯著高于CA125、HE4的診斷靈敏度63.16%、52.38%。劉春華等[22]對78例卵巢癌患者進行CTC與CA125檢測后發現，隨著化療周期的延長，患者CTC、CA125水平均呈下降趨勢，但CTC與CA125水平變化無相關性。本研究結果顯示, FR+-CTC可作為卵巢癌的獨立預測因子，但FR+-CTC與CA125、HE4無顯著相關性。相關研究[29]報道，卵巢癌晚期患者的平均CTC計數高于卵巢癌Ⅰ～Ⅱ期患者。本研究還發現，相較于Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者, Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌患者中更易檢出FR+-CTC陽性、CA125陽性，且FR+-CTC陽性患者中Ⅰ～Ⅱ期者占比相較于CA125陽性患者中更高，即CTC比CA125更靈敏，可輔助診斷早期卵巢癌。

綜上所述，卵巢癌患者外周血FR+-CTC含量較健康人顯著升高，治療后外周血FR+-CTC含量較治療前有所下降，且FR+-CTC陽性患者中Ⅰ～Ⅱ期者占比相較于CA125陽性患者中更高，表明FR+-CTC可用于卵巢癌的早期輔助診斷和療效監測，為卵巢癌的早診斷、早治療提供參考依據，進而改善卵巢癌患者的預后。此外, CA125、HE4對卵巢癌具有良好的診斷價值，故推測FR+-CTC聯合CA125、HE4檢測可進一步提高卵巢癌的早期檢出率，但未來還需開展大量研究加以證實。