電針太沖穴及曲池穴拮抗應激性高血壓前期大鼠胸主動脈外膜重構的機制研究

謝曉佳, 曹 銳, 劉清國, 黃 粵, 朱宏勛, 趙世同, 趙靜怡

(1. 首都醫科大學附屬北京朝陽醫院 中醫科, 北京, 100020;2. 北京中醫藥大學針灸推拿學院, 北京, 100105)

隨著現代社會生活節奏的加快，全球應激性高血壓發病率逐年攀升，為將高血壓防治陣線前移，美國預防、檢測、評估與治療高血壓全國聯合委員會第七次報告(JNC 7)提出了“高血壓前期(收縮壓120～139 mmHg, 舒張壓80～89 mmHg)”的概念[1]。研究[2]表明，高血壓前期發病呈年輕化的趨勢，并且已經出現了心、腦、腎等靶器官的損害，而血管重構(VR)是導致靶器官損傷的病理基礎，若能在前期階段進行有效的干預，則能較大程度上逆轉靶器官損傷進程。近年來研究[3]表明，血管外膜是血管病變的始動者，其病變順序應該是“由外向內”。目前，血管外膜已成為治療血管病變的新方向，“外膜炎癥”是動脈硬化(AS)的始動環節，在AS發生早期即被激活，產生白細胞介素-6(IL-6)等炎性因子，并可促使血管外膜成纖維細胞(AF)被激活，刺激細胞外基質(ECM)合成增多，進而導致AS[4]。

轉化生長因子β1(TGF-β1)可參與調節AF增殖、轉化、遷移和ECM產生，是公認的影響AF最直接、最重要的細胞因子。Smads是TGF-β1信號通路下游的關鍵調節因子，可將其信號由膜外轉至核內[5]。TGF-β1可通過Smads通路促進AF轉化為肌成纖維細胞(MF)與ECM沉積，最終導致AS[6]。高血壓前期屬于中醫治未病的典型，在這一階段即運用針刺治療方法具有獨特的優勢。本研究在針刺治未病理論的指導下，觀察電針太沖、曲池穴對應激性高血壓前期大鼠(SIPR)血壓、血管外膜病理形態的影響，探討電針降壓及保護靶器官的具體機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

將30只由北京維通利華公司提供的無特定病原體(SPF)級雄性Wistar大鼠飼養于北京呼吸疾病研究所動物房，大鼠體質量(220±30) g, 室溫(20±1)℃，相對濕度50%，通風良好，定期紫外線消毒，清掃糞便，更換墊料。將30只大鼠隨機分為模型組、電針組、空白組，每組10只。

1.2 造模方法

運用足底電擊結合噪聲刺激造模。采用MG-2型迷宮刺激器(上海繼德教學實驗器械廠)制備SIPR模型。模型組、電針組大鼠在每天上午、下午同一時間各接受1次持續2 h的電擊足底結合噪聲應激刺激。應激時將大鼠放入由細銅柵組成的90 cm×90 cm×50 cm的籠子底部，通過銅柵間斷給予大鼠足底電脈沖電刺激(脈沖電壓為40～80 V, 每2～25 s隨機發生1次，每次持續50 ms), 迷宮刺激器上方的蜂鳴器同時發出噪聲刺激，強度為80～100 db, 持續50 ms, 造模周期為14 d。

1.3 干預方式

將各組大鼠固定在特制鼠套中，露出四肢、尾部，固定20 min。選穴參照《實驗針灸學》: 雙側太沖穴(后肢足背1、2趾骨凹陷處)，直刺1 mm; 雙側曲池穴(肘關節外側前方凹陷中)，直刺4 mm。選用針具為中研太和牌一次性毫針(規格0.16 mm×7 mm), 電針組進針后連接LH202H型韓式電針儀，陽極接太沖，陰極接曲池穴，電流刺激強度為1 mA, 頻率2 Hz, 留針20 min。電針組大鼠從接受造模的第1天起接受針刺干預，直到第14天造模結束，所有操作均由同一人于每天下午固定時間進行。

1.4 血壓測定

在復合應激刺激開始的前l d以及復合應激刺激開始的第3、5、7、9、11、13、15天下午刺激結束后2 h以及電針治療14 d結束后，分別用智能無創血壓儀(BP-98A，德國制造)測量各組大鼠尾動脈的收縮壓(連測3次，取均值)，數值波動范圍不超過±10 mmHg為宜。

1.5 動物取材

采用20%氨基甲酸乙酯腹腔注射進行全身麻醉，劑量為每100 g 1 mL, 將大鼠固定于手術架上，開胸腔，剪取胸主動脈0.5 cm, 立即置于冰上操作，剔除結締組織，采用生理鹽水清洗，置于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.6 蘇木素-伊紅染色(HE染色)觀察組織形態改變

取1.5步驟中的大鼠胸主動脈組織約1 cm, 置于4%多聚甲醛中固定后脫水，石蠟包埋切片，經二甲苯脫蠟乙醇水化, HE染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透化，中性樹膠封片固定，光鏡下觀察。

1.7 Masson染色觀察組織膠原纖維改變

取1.6步驟中的切片，將切片脫蠟至水，蘇木素染色，麗春紅浸染，磷鉬酸分化，苯胺藍染色，1%冰醋酸分化，中性樹膠固封，鏡下觀察。

1.8 逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定各組

大鼠主動脈組織TGF-β1、IL-6、Smad3、白細胞介素-10(IL-10)的mRNA表達

取1.5步驟中的大鼠胸主動脈組織約10 mg, 按照Trizol試劑(美國 GBCO公司)說明書提取主動脈組織總RNA, 采用核酸蛋白分析儀檢測其濃度和純度，取總RNA, 參照RT-PCR試劑盒(日本 Toyobo)說明書進行逆轉錄反應，取2 μL的逆轉錄產物，以TaqDAN 聚合酶進行PCR擴增反應，以β-action為內參，計算各樣本TGF-β1、IL-6、Smad3、IL-10的mRNA條帶光密度值與β-actionmRNA條帶的比值。

1.9 Western blot法檢測各組大鼠主動脈中

Smad7、α-平滑肌激動蛋白(α-SMA)、Ⅰ型和Ⅲ型膠原的蛋白表達水平

取1.5步驟中的大鼠胸主動脈組織約30 mg, 加入300 μL 蛋白裂解液中研磨，提取胸主動脈組織總蛋白，采用BCA定量法測定總蛋白濃度，按照試劑盒說明書制備分離膠與濃縮膠; 電泳結束后，轉印至PVDF膜上，室溫封閉60 min, 加入一抗Ⅰ型膠原 (1∶1 000)、Ⅲ型膠原 (1∶1 000)、Smad7 (1∶800)、α-SMA (1∶1 000) 4 ℃孵育過夜，室溫下用TBST清洗膜3次，添加二抗 (1∶10 000), 室溫孵育60 min, TBST洗膜，化學發光法進行曝光拍照保存，以β-actin蛋白為內參，采用Image J軟件分析Smad7、α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型膠原條帶的灰度值。

1.10 統計學方法

2 結 果

2.1 各組大鼠收縮壓變化

3組大鼠針刺治療前的收縮壓比較，差異無統計學意義(P>0.05)。第3天時，與空白組比較，模型組大鼠收縮壓升高到120 mmHg, 第14天時收縮壓持續升高并始終保持在高血壓前期狀態(120～139 mmHg), 提示造模成功。與模型組比較，電針組第5、7、9、11、13、15天時收縮壓下降，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

mmHg

2.2 各組大鼠胸主動脈外膜HE染色的病理變化

空白組胸主動脈管壁無增厚，血管內膜均勻光滑，外膜厚度均一，外膜與中膜分界明顯; 模型組胸主動脈管壁增厚，外膜厚度明顯增加，細胞增生活躍，排列紊亂，有較多炎性細胞附著，有的出現剝脫甚至斷裂，血管內皮欠光滑，不均勻，內膜上有少量炎癥細胞附著，外膜與中膜分界不清晰; 電針組胸主動脈內膜較為光滑均勻，中層平滑肌細胞排列較規整，炎性細胞浸潤減少，較空白組雖有外膜厚度增加、細胞輕度增生、排列欠整齊，但外膜與中膜分界較清晰，較模型組有明顯改善。見圖1(藍色箭頭處為增厚的血管外膜)。

圖1 各組大鼠胸主動脈外膜HE染色(放大倍數200倍)

2.3 各組大鼠胸主動脈Masson染色的病理變化

空白組胸主動脈細胞排列整齊，血管內膜、中膜、外膜細胞間質散在有少量藍色膠原纖維; 模型組胸主動脈細胞排列紊亂，血管內膜、中膜、外膜均可見大量藍色膠原蛋白沉積，以外膜較為明顯; 電針組膠原沉積程度減輕。見圖2(黑色箭頭處為膠原蛋白沉積)。

圖2 各組大鼠胸主動脈Masson染色(放大倍數200倍)

2.4 各組大鼠胸主動脈組織TGF-β1、IL-6、Smad3、IL-10的mRNA表達

與空白組比較，模型組大鼠TGF-β1、Smad3、IL-6、IL-10的mRNA表達量均增加，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01); 與模型組比較，電針組大鼠TGF-β1、Smad3、IL-6的mRNA表達量均降低,IL-10mRNA增高，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠胸主動脈組織TGF-β1、IL-6、Smad3、IL-10的mRNA表達

2.5 各組大鼠胸主動脈組織Smad7、α-SMA、Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白表達

與空白組比較，模型組大鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白以及α-SMA蛋白表達均增加, Smad7蛋白表達下降，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01); 與模型組比較，電針組Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白、α-SMA蛋白表達降低, Smad7蛋白表達升高，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表3、圖3。

表3 各組大鼠胸主動脈Smad7、α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型膠原的蛋白表達

圖3 各組大鼠胸主動脈Smad7、α-SMA、Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白表達

3 討 論

高血壓前期屬于中醫學“眩暈” “頭痛”“肝風”等范疇[7-8], 屬本虛標實之證，基本病機為氣血失調、氣血上逆，故應采取清泄降逆、調和氣血為基礎的治療原則。太沖穴歸于少氣多血之足厥陰經，為其輸穴，又是肝的原穴，故太沖穴具有較好的平沖降逆功效。陽明經氣血豐富，曲池穴為手陽明經之合，且大腸又為六腑之一，以通降為順，五行亦屬金，專克肝木，故曲池穴偏于清熱調氣和血，兩穴相配可標本兼顧發揮平肝潛陽、柔肝熄風、調氣降逆之效，是臨床治療高血壓病常用且較好的穴位配伍[9-11]。本研究發現電針對于SIPR具有明顯的降壓效果，且短期效果較好，同時電針組主動脈損害較輕，說明電針對于SIPR主動脈具有一定的保護作用[12-14]。本研究應用足底電擊結合噪聲刺激的復合造模方法[15-16]制備SIPR大鼠模型，發現模型組大鼠均出現易激怒、互相撕咬打架、睛紅充血、毛色發黃變澀、食欲下降、糞便干結等外觀和行為變化，為近似高血壓中醫辨證肝陽上亢型模型[17-18]。根據模型組HE染色、Masson染色結果顯示，在高血壓前期階段即可出現血管損傷，且外膜損傷出現早于內膜，損傷程度重于內膜[19-20]。

針對AS的發病機制，既往研究[3]多集中在血管內膜方面，近年來發現AS的本質是血管壁炎癥反應，而外膜炎癥是引起AS的始動因素。作為血管外膜主要細胞成分的AF在生理條件下處于靜息狀態，當受到缺氧、炎癥和細胞因子等因素刺激時，會被激活并表型轉化為MF，MF增殖、遷移能力增強，并分泌TGF-β1、TNF-α、IL-6、基質金屬蛋白酶等多種細胞因子和Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白等ECM, 推動AS的發生發展[4]。血管外膜的早期活化增殖及炎癥反應在AS中發揮了關鍵作用，血管外膜有可能成為治療血管重構的新靶點。研究[21]表明SHR大鼠血管外膜AF上炎癥介質表達上調，可進一步增強大鼠血管外膜AF的遷移能力和炎癥級聯反應，加快AS進程。IL-6是由血管外膜AF所產生，可以促進外膜AF的增殖和ECM中膠原的合成，導致AS[22]。IL-10是由單核巨噬細胞分泌的一種抗炎細胞因子，已被證明可以抑制AF的增殖和Ⅰ型、Ⅲ型膠原的表達[23]。本研究表明，電針能降低IL-6mRNA并升高IL-10mRNA水平，提示電針太沖、曲池穴可改善SIPR血管外膜重構，其機制可能與通過抑制IL-6mRNA和升高IL-10mRNA表達從而減輕血管外膜炎癥反應有關。

AF是血管外膜的主要細胞成分，在生理條件下, AF處于靜息狀態。當受到炎癥、缺氧和細胞因子的刺激時，其會被激活并轉化為MF, 研究[24]表明AF的增殖與膠原纖維等ECM的增加是AS的重要機制，TGF-β1參與其中，并且是公認的影響AF生物功能最直接、最重要的細胞因子。TGF-β1可使AF表型發生改變而成為MF，其中α-SMA作為AF活化的主要標記物，亦是探討血管老化的重要檢測指標，可以用來衡量AS的程度[25]。目前TGF-β1的信號轉導通路已基本闡明。近年來研究[5]表明, TGF-β1及其介導的Smads信號轉導通路在血管外膜重構機制中發揮重要作用。TGF-β1可以招募其下游效應轉錄因子Smad2、Smad3、Smad4, 并將其磷酸化形成Smads復合物，能將信號從膜外轉導至核內，上調與ECM合成相關的基因表達，導致膠原等沉積，并能促進AF向MF轉化，最終導致血管外膜重構。Smad7是抑制性信號蛋白，是TGF-β信號通路關鍵負調控因子，能與Smad2、Smad3競爭性地結合TGF-β1受體并阻斷其激活，進而抑制AS。本研究模型組大鼠胸主動脈TGF-β1mRNA和Smad3mRNA表達量均明顯增加，而電針組均明顯下降，且電針能有效抑制SIPR胸主動脈α-SMA以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達，增加Smad7蛋白表達[26], 表明電針改善SIPR血管外膜重構機制可能與參與調控TGF-β1/Smads信號通路有關。

綜上所述，電針太沖、曲池穴對SIPR的血管外膜重構有良好的改善作用，電針發揮作用機制可能與參與調控TGF-β1/Smads信號轉導通路和抑制血管外膜炎癥反應相關。