電針對缺氧缺血性腦損傷大鼠海馬神經元自噬及IGF-1/PI3K/Akt通路的影響

曹 娟, 王紅怡, 王麗欣, 陳小寧, 林 秋,楊慶紅, 陳東追, 符玉秀

(1. 海南現代婦女兒童醫院, 海南 海口, 571100;2. 海南醫學院基礎醫學與生命科學學院免疫學教研室, 海南 海口, 571100)

缺氧缺血性腦損傷(HIBD)是一種因氧氣和流向大腦的腦血流減少導致神經功能缺損而引發的疾病，是新生兒中常見且嚴重的神經系統疾病，也是導致新生兒死亡的主要原因之一[1]。幸存的嬰兒通常伴有腦癱、智力低下和其他后遺癥，嚴重影響生存質量[2]。目前，臨床尚缺乏用于治療HIBD的標準和具體措施，因此迫切需要尋找新的神經保護療法來減輕HIBD導致的神經損傷。近年來研究[3]發現胰島素樣生長因子1(IGF-1)與HIBD關系密切，具有促進神經元及膠質細胞增生分化和營養支持的功能，在腦缺血、缺氧后保護神經元、修復受損神經元及恢復認知功能損害等過程中發揮重要作用，有望作為腦保護劑用于臨床缺血缺氧的治療。

自噬參與HIBD的發生，研究[4-5]發現當缺氧缺血刺激誘導自噬過度激活時會加劇腦損傷，在HIBD后通過抑制自噬激活可發揮神經保護作用。研究[6]顯示針刺可通過上調IGF-1的表達來改善腦卒中后血管性認知障礙，促進神經發育，治療小兒腦性癱瘓[7]。電針是在針灸針上接通微量不連續或連續的電流，以進一步將針刺刺激產生的效應傳導至大腦，從而促進神經功能的恢復與重塑[8]。電針能提高IGF-1表達水平，改善腦梗死患者神經功能及腦血流動力學[9]。IGF-1主要通過調控磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)發揮神經保護作用[10-11]。本研究通過建立新生大鼠HIBD模型，探討電針對新生大鼠IGF-1的影響及其可能的作用機制，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Sprague Dawley孕鼠15只，產仔10～12只，購自上海SLAC實驗動物有限公司，生產許可證號為SCXK(滬)2019-0006, 動物質量合格證號為202021 563.65。將孕鼠在單獨的無菌塑料籠中飼養，在22～23 ℃、55%～60%濕度以及12 h光照與12 h黑暗的周期交替下進行，孕鼠可自由進食和飲水。使用108只7 d日齡的Sprague Dawley(SD)大鼠幼崽進行實驗，體質量15～20 g。本研究獲得機構動物護理和使用委員會批準{2020[倫理]第(3)號)}，并遵循《實驗動物的護理和使用指南》。

1.2 主要試劑及儀器

IGF-1(瑞士Roche公司，貨號250-19); LY294002(PI3K抑制劑，北京百奧萊博科技有限公司，貨號YT333); HE染色試劑(C0105)、RIPA裂解液(P0013B)、BCA試劑盒(P0010)均購自碧云天生物科技公司; 大鼠胰島素樣生長因子1(IGF-1)檢測試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，貨號ZN2874-HXK); 兔抗大鼠PI3K(ab191606)、p-PI3K(ab182651)、AKT(ab18785)、p-AKT(ab38449)、LC3A/B(ab128025)、Beclin-1(ab210498)、β-actin(ab8227)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)、山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor?488)(ab150077)(綠色)、小鼠抗NeuN(ab279296)、山羊抗小鼠IgG H&L(Alexa Fluor?594)(ab150116)(紅色)均購自英國abcam公司。

電針儀(G6805-2A)購自上海華誼醫療儀器有限公司; 透射電子顯微鏡(H-7500)購自日本日立公司; iMark680多功能酶標儀、蛋白轉膜裝置(美國Bio-Rad公司); 倒置熒光顯微鏡(IX73)購自日本Olympus公司。

1.3 分組、模型制備及處理

從108只新生大鼠中隨機選取18只為假手術組，均用3%的異氟烷麻醉，并在整個手術過程中以2%的麻醉劑量進行維持。除假手術組外，其他大鼠采用左頸總動脈結扎和低氧處理2 h的方法構建新生大鼠HIBD模型[12]。在頸部中線做小切口，分離并結扎左頸總動脈; 縫合切口，將幼崽置于加熱的毯子上恢復1 h, 而后將其放入部分浸沒在37 ℃水浴中的500 mL密封廣口瓶中; 將含8%氧氣和92%氮氣的混合氣體送入廣口瓶中2 h; 將大鼠移出并暴露于空氣中，觀察大鼠的自由運動，然后將其放回各自的母鼠籠中。假手術組僅分離左頸總動脈，不進行結扎和缺氧處理。若大鼠出現乏力、站立不穩、左側肢體癱瘓與提尾時左側前爪緊抱等表現，提示HIBD模型構建成功。造模成功后存活72只大鼠，死亡18只，考慮到新生大鼠各器官發育不完善，造模比較艱難，故造模成功率80%屬正常可接受的范圍。

將模型制備成功的大鼠隨機分為4組，即模型組、IGF-1組(0.2 mg/kg)[13]、電針組、電針聯合LY294002組(電針+PI3K抑制劑0.3 mg/kg)[14], IGF-1組在缺氧缺血后即刻腹腔注射IGF-1(0.2 mg/kg), 電針組在造模后2 h按照實驗動物學所公認的針灸取穴位置，選取神庭(大鼠頭前正中線，額頂骨縫交線前方)、百會穴(大鼠頭部前正中線，兩耳尖連線中點)開始電針治療，應用G6805-2A電針儀進行電針刺激，電壓峰值4 V, 疏密波，以針體輕輕抖動為標準，頻率維持在5～10 Hz, 10 min/次, 1次/d; 電針聯合LY294002組在缺氧缺血后即刻腹腔注射LY294002(0.3 mg/kg), 造模后2 h開始電針治療，操作方法同電針組。電針治療14 d后進行取材和相關指標的檢測。

1.4 取材及指標檢測

1.4.1 神經功能缺陷評分: 各組大鼠在手術清醒后和電針治療結束后進行神經行為評分。評分標準: 0分為無明顯神經功能缺損; 1分為提尾時不能伸展對側前肢; 2分為行走時向對側旋轉; 3為行走時向對側傾斜; 4分為不能自主活動或伴意識障礙。分數越高表示神經功能缺陷越嚴重。

1.4.2 酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測腦組織IGF-1的含量: 行為學檢測結束后，每組隨機選取6只大鼠，斷頭取腦，分離海馬組織，稱重后按1∶9的比例加入預冷的生理鹽水，研磨后離心，取上清為10%的腦組織勻漿, ELISA試劑盒檢測大鼠腦組織勻漿中IGF-1的含量。

1.4.3 腦組織病理學變化: 每組隨機選取6只大鼠進行麻醉，用4.0%多聚甲醛與2.5%戊二醛的混合溶液灌注，然后斷頭取腦，沿冠狀位切分為2個部分，一部分經2.5%戊二醛溶液固定，用于透射電鏡; 另一部分經4.0%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片后行HE染色，觀察腦組織病理學變化。

1.4.4 透射電鏡觀察細胞自噬情況: 取戊二醛溶液固定的腦組織，采用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗3次后, 1%鋨酸固定液, 4 ℃固定2 h。梯度酒精脫水，浸透包埋，行超薄切片(60～70 nm厚)，染色，顯微鏡下觀察海馬CA1區自噬小體的形成情況并拍照。

1.4.5 免疫熒光雙標法檢測LC3與神經元特異性核蛋白(NeuN)的共定位表達: 取1.4.3步驟中的腦組織石蠟切片，二甲苯脫蠟, 磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后微波修復15 min, 正常山羊血清封閉20 min, 加入一抗(兔抗LC3和小鼠抗NeuN, 1∶100), 4 ℃孵育過夜，洗去一抗，分別加入熒光二抗(Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔和Alexa Fluor 594標記的山羊抗小鼠IgG, 1∶300), 37 ℃避光孵育1 h, PBS沖洗3次，抗熒光淬滅劑封片，顯微鏡下對切片進行觀察和拍照。

1.4.6 Western blot法檢測海馬組織PI3K/Akt通路、自噬相關蛋白的表達: 每組剩余6只大鼠，取腦，分離海馬組織。按照試劑盒說明書的操作提取海馬組織中的總蛋白, BCA法測定蛋白濃度后取等量蛋白質樣品上樣, SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉法轉膜, 5%脫脂奶粉封閉，加入一抗(PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、自噬基因Beclin-1、LC3A/B, 按1∶1 000的比例稀釋; β-actin按1∶2 000的比例稀釋), 4 ℃下孵育過夜, HRP標記的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h, ECL顯色，以β-actin為內參，通過與內參的灰度比得出目的條帶的相對表達水平。

1.5 統計學分析

2 結 果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分比較

在模型制備前，所有大鼠的神經功能均正常; 模型制備成功后，與假手術組相比，HIBD模型組大鼠出現行動遲緩、活動減少、左側肢體癱瘓、提尾時左側前爪緊抱等表現，神經功能缺損評分升高，差異有統計學意義(P<0.05); 治療結束后，與模型組相比, IGF-1組、電針組、電針聯合LY294002組神經功能改善，神經功能缺損評分降低，差異有統計學意義(P<0.05); 與電針組相比，電針聯合LY294002組神經功能缺損評分升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分比較 分

2.2 各組大鼠腦組織IGF-1的含量

與假手術組相比，模型組大鼠腦組織IGF-1的含量降低; 與模型組相比, IGF-1組、電針組、電針聯合LY294002組大鼠腦組織IGF-1的含量增加; 與電針組相比，電針聯合LY294002組腦組織IGF-1的含量降低; 上述組間差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腦組織IGF-1的含量

2.3 各組大鼠腦組織病理學變化

假手術組大鼠腦組織海馬CA1區細胞形態規則、排列緊密，未出現明顯的損傷; 模型組大鼠海馬中存在嚴重的病理損傷, CA1區可見神經元腫脹、細胞核固縮、排列疏松、神經元密度降低; IGF-1組、電針組大鼠上述病理改變明顯減輕，神經元密度增加; 與電針組相比，電針聯合LY294002組大鼠海馬神經細胞數量明顯減少。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織HE染色(放大倍數200倍)

2.4 各組大鼠海馬CA1區自噬情況

假手術組大鼠海馬CA1區神經元結構基本正常，胞質內細胞器形態及數量正常，未見自噬小體/溶酶體的形成; 模型組大鼠海馬CA1區細胞結構破壞，呈空泡樣變的神經元較多，可見大量溶酶體和自噬小體形成; IGF-1組、電針組大鼠海馬CA1區可見自噬小體/溶酶體數量減少，且細胞形態相對正常，可見相對完整的線粒體和內質網; 與電針組相比，電針聯合LY294002組自噬小體/溶酶體數量增加。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬CA1區自噬情況(放大倍數30 000倍)

2.5 各組大鼠海馬CA1區LC3與NeuN的共定位表達

假手術組大鼠海馬CA1區未見LC3與NeuN共表達的神經元; 模型組海馬中可見大量LC3/NeuN強陽性的LC3神經元; IGF-1組、電針組大鼠海馬CA1區LC3/NeuN共表達的神經元明顯減少; 與電針組相比，電針聯合LY294002組LC3/NeuN共表達的神經元數量增加。見圖3。

圖3 各組大鼠海馬CA1區LC3與NeuN的共定位表達(放大倍數200倍)

2.6 各組大鼠海馬組織PI3K/Akt通路、自噬相關蛋白的表達

Western blot法檢測結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠海馬組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt的表達降低, Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達升高; 與模型組相比, IGF-1組、電針組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt的表達升高, Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達降低; 與電針組相比，電針聯合LY294002組海馬組織p-Akt/Akt的表達降低, Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達升高; 上述組間差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4、表3。

圖4 各組大鼠海馬組織PI3K/Akt通路、自噬相關蛋白的表達

表3 各組大鼠腦組織PI3K/Akt通路、自噬相關蛋白的表達

3 討 論

HIBD可能引起永久性的腦損傷，導致神經系統殘疾甚至死亡。在缺血的早期階段，海馬神經元很容易受損，而壞死、凋亡和自噬是神經元死亡的主要途徑。自噬參與了HIBD的發病機制，有研究[15]認為促進自噬或可部分緩解HIBD病情，但當缺氧、缺血刺激誘導自噬過度激活時，則會加劇腦損傷[16]。本研究結果顯示, HIBD模型大鼠具有明顯的神經功能缺損表現，通過觀察海馬神經細胞的超微結構變化，發現HIBD大鼠缺血側CA1區細胞結構破壞，溶酶體和自噬小體數量顯著增多，免疫熒光共定位結果進一步顯示海馬LC3/NeuN共表達的神經元顯著增多，說明HIBD大鼠海馬神經元自噬被激活。研究[17-18]表明自噬的抑制在體內和體外的新生兒腦缺氧、缺血模型中可以提供神經保護作用。

針刺對HIBD的療效肯定[7-8]。研究[19-20]發現，針刺可通過改善腦血流量、調節自噬、抑制細胞凋亡、促進神經營養因子及其受體表達、刺激神經干細胞的增殖和分化等發揮對損傷腦組織的保護作用。電針是在針灸針上接通微量電流，可加強針刺刺激產生的效應，在鎮痛、緩解肢體痙攣、改善運動障礙等方面療效顯著，具有不良反應少、可重復性好、療效佳等優點。黃金等[21]發現，電針可上調大鼠皮質及海馬區PI3K、AKT、Beclin-1的表達，改善腦卒中后認知障礙; 孫曉偉等[22]發現電針在再灌注中晚期可降低LC3A/B蛋白表達，抑制腦缺血再灌注大鼠神經細胞自噬的過度激活，從而拮抗神經元的進一步損傷; 黃倩茹等[23]發現電針可促進缺氧缺血性腦損傷大鼠的發育; 上述研究均說明電針可能通過調節自噬來減輕腦缺血缺氧后的神經元損傷。本研究結果顯示，電針干預后大鼠神經功能缺損情況明顯減輕; HE染色和免疫熒光共定位結果顯示電針可減少海馬神經元丟失，減少自噬小體和LC3陽性表達的神經元的數量，減輕海馬組織損傷; 上述結果說明電針可能通過抑制自噬減輕新生大鼠HIBD。

IGF-1是一種活性單鏈多肽分子，廣泛存在于哺乳動物中樞神經系統中，可以透過血腦屏障，是維持神經元存活的神經因子之一，能對各種神經損傷產生反應，激活多種細胞內信號傳導通路。UMRAN R M等[24]研究表明，新生兒在子宮內或出生時發生缺血缺氧時, IGF-1水平較低，與HIBD的預后相關; 增加神經細胞對IGF-1的分泌作用可能減輕HIBD[3-4]。實驗和臨床研究均表明早期補充IGF-1可以減少缺氧/缺血事件后的腦損傷[25-26]。本研究結果也顯示，與正常新生大鼠相比, HIBD大鼠腦組織中IGF-1水平顯著降低，而給予IGF-1和電針干預后, IGF-1的水平明顯增加，海馬神經元損傷減輕，說明電針可能是通過上調IGF-1的表達而減輕新生大鼠HIBD。PI3K/Akt信號通路是其發揮作用的主要通路, Akt是PI3K途徑的中心介質, IGF-1與其受體結合后，可通過PI3K激活Akt的磷酸化，進一步磷酸化下游的mTOR及其他靶蛋白，從而介導炎癥、自噬和凋亡等多種生物學效應，并對新生大鼠腦缺氧缺血損傷發揮神經保護作用[14]。WANG X W等[5]發現IGF-1通過IGF-1R/PI3K-Akt-mTOR途徑抑制帕金森病動物和細胞模型中的過度自噬; ZHAO B等[27]發現在缺氧缺血性腦病中, IGF-1可改善缺氧引起的磷酸化Akt的下調，保護神經干細胞免受缺氧誘導的凋亡。本研究結果顯示，給予IGF-1和電針干預后, HIBD大鼠海馬組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt的表達顯著升高, Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達顯著降低；使用PI3K的抑制劑LY294002能顯著降低IGF-1的水平，減弱電針對海馬組織IGF-1/PI3K/Akt通路的激活和海馬神經元自噬的抑制作用; 上述結果提示電針可能通過激活IGF-1/PI3K/Akt通路來抑制HIBD大鼠海馬神經元過度自噬。

綜上所述，電針可能通過激活IGF-1/PI3K/Akt通路而抑制海馬神經元過度自噬，減輕新生大鼠HIBD。由于自噬的雙重作用，在腦缺氧缺血的不同時期，電針可能發揮不同的作用，其在腦缺氧、缺血的早期對自噬的影響有待進一步的研究。