針刺對胃潰瘍大鼠胃黏膜損傷及MEK/ERK通路相關蛋白表達的影響

汪婧修,梁娟

(十堰市婦幼保健院,十堰 442000)

應激性胃潰瘍(stress gastric ulcer,SGU)是機體在應激狀態下所出現的一種急性胃黏膜病變,臨床表現為胃底和胃體部黏膜表淺潰瘍、糜爛或出血[1]。其發病機制仍未完全明確,目前尚沒有針對性的治療藥物。近年來,針灸對SGU的治療效果受到廣泛關注,針刺治療起效迅速,且具有副作用小,價格低廉的優勢,作為西藥的替代療法在SGU的臨床治療中發揮作用[2]。“合募配穴”為SGU治療的重要指導思想,足三里為足陽明胃經的合穴,胃腑的下合穴,中脘為胃之募穴,二者配合應用能夠促進胃黏膜愈合,減少潰瘍復發,對SGU具有確切的臨床療效[3]。絲裂原活化蛋白激酶的激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)/胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信號途徑能夠調控緊密連接蛋白表達,對于胃黏膜的損傷與修復具有重要影響,與SGU的發生密切相關[4]。已有研究[5]表明,艾灸足三里和中脘穴能夠上調大鼠胃組織MEK/ERK通路蛋白的表達,從而促進脾虛證胃黏膜的修復。因此,本實驗以MEK/ERK通路為研究指標,通過束縛-冷應激法建立SGU大鼠模型,觀察針刺中脘、足三里對SGU的治療效果及其修復胃黏膜損傷的相關機制,同時設立針刺對照組,比較中脘、足三里“合募配穴”與針刺非經穴的療效差異。

1 材料及方法

1.1 實驗動物

58只SPF級雄性SD大鼠,體質量(200±20)g,均購自湖北省實驗動物研究中心,動物合格證號為SCXK(鄂)2015-0018。飼養于室溫 18～25 ℃,相對濕度45%～55%環境中,實驗前適應性飼養1周。動物實驗經十堰市婦幼保健院實驗動物倫理委員會審核通過,實驗過程中嚴格遵守實驗動物飼養和使用原則。

1.2 藥品及試劑

奧美拉唑腸溶片(20 mg/片)購自阿斯利康制藥有限公司,表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)ELISA試劑盒(貨號 ml003029)、轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)-αELISA試劑盒(貨號 ml002895)購自上海酶聯生物科技有限公司,總蛋白檢測試劑盒(貨號QPBCA)購自Sigama公司,AntipMEK(貨號 ab96379)、Anti-pERK(貨號 ab201015)、Anti-ZO-1(貨號 ab190085)、Anti-Occludin(貨號ab216327)購自美國 Abcam公司,Anti-β-actin(貨號MAB8929)購自美國R＆D公司。

1.3 模型制備

采用束縛-冷應激法制備大鼠應激性胃潰瘍模型[6]。大鼠造模前 24 h禁食不禁水,大鼠乙醚麻醉后仰臥束縛在鼠板上,將鼠板直立浸于溫度為20 ℃的水箱中,水平面與胸骨劍突部位齊平,水浸10 h后將鼠板取出,大鼠松綁。肉眼觀察大鼠胃黏膜充血、水腫、潮紅,胃體部出現數處斑點狀糜爛、潰瘍及出血,組織病理檢測見胃黏膜炎細胞浸潤,黏膜缺損,為造模成功。

1.4 分組及干預

58只SD大鼠按體質量隨機分為空白組、模型組、針刺治療組、藥物對照組及針刺對照組,空白組10只,其余各組各12只。除空白組外,其余大鼠均采用WRS法制備SGU模型。造模過程中,各組大鼠均未見死亡情況,每組取2只大鼠驗證模型成功后,針刺治療組參照《實驗針灸學》[7]中大鼠常用針灸穴位定位取穴,于造模成功第2天取大鼠中脘(臍中上20 mm處)及雙側足三里(膝關節后外側,腓骨小頭下5 mm處)給予針刺治療,每次30 min,每5 min捻轉行針30 s,每日1次,持續治療7 d。針刺對照組針刺中脘及足三里旁開5 mm處非穴位對照點,療程同針刺治療組。藥物對照組給予奧美拉唑腸溶片溶液0.2 mg/kg灌胃治療,每日1次,連續灌胃7 d。模型組固定于鼠板而不予針刺處理,每次30 min,每日1次。空白組正常喂養,不予處理。

1.5 指標檢測

1.5.1 胃黏膜損傷指數(ulcer index,UI)檢測

治療后,各組大鼠腹腔注射水合氯醛[400 mg/(kg·bw)]麻醉,腹主動脈取血后結扎賁門和幽門,向胃內注射 10 mL生理鹽水,將全胃取出后,置于生理鹽水中再次固定 20 min。沿胃大彎剪開,沖洗胃內容物后鋪平,立體顯微鏡下以目鏡測微尺測量胃黏膜損傷長度。參照GUTH P H等[8]所制定的方法計算胃黏膜損傷指數(UI),斑點狀糜爛計1分;糜爛損傷長度＜1 mm計2分;長度1～2 mm計為3分;長度＞2 mm且≤ 4 mm計為4分;長度＞4 mm計為5分;當寬度＞1 mm時,計分按2倍計算,UI＝胃黏膜各處糜爛分值相加的總和。

1.5.2 胃黏膜組織形態學觀察

UI測量后,將大鼠胃組織于 10%多聚甲醛中固定48 h后取出,常規脫水、透明后進行石蠟包埋,選取大鼠潰瘍明顯處作5 μm厚切片,再經烘片、脫蠟至水、蘇木素-伊紅染色、70%鹽酸乙醇分化、脫水透明后用中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察大鼠胃黏膜組織的形態學變化。

1.5.3 血清中EGF、TGF-α含量檢測

采用酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測各組大鼠血清中 EGF、TGF-α的含量。大鼠腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉,腹主動脈取血,3 000 r/min離心后取血清,置于-20 ℃冰箱待測。血清于常溫下放置1 h后,3 000 r/min離心15 min,按ELISA試劑盒說明書要求配置標準品及試劑,加入樣品稀釋劑40 μL,抗體100 μL,血清10μL,37 ℃溫箱中孵育1 h,洗滌液清洗5次,加入顯色液100 μL,37 ℃避光孵育15 min,加入終止液50 μL,酶標儀450 nm下檢測各組反應孔OD值。建立標準曲線,計算各樣本EGF、TGF-α含量。

1.5.4 胃黏膜組織 pMEK、pERK及 ZO-1、Occludin蛋白表達檢測

取大鼠胃黏膜組織100～200 mg,剪碎后置于裂解液中,使用組織勻漿器冰上勻漿,4 ℃離心機12 000 r/min離心20 min,提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。進行制膠、上樣、電泳、轉膜和封閉后,加入稀釋的pMEK、pERK、Occludin、β-actin(1:1 000)及ZO-1(1:500)一抗4 ℃孵育過夜,TBST洗膜,HRP標記的二抗(1:5 000)37 ℃孵育1 h,TBST洗膜。ECL發光液孵育后,凝膠成像分析系統曝光圖像,計算目標蛋白與相應內參的光密度比值,分析蛋白含量。

1.6 統計學分析

采用SPSS20.0統計軟件對數據進行統計分析。計量資料符合正態分布,用均數±標準差表示;多組間比較采用單因素方差分析;方差齊組間兩兩比較用 LSD檢驗,方差不齊則采用GamesHowell分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 大鼠一般情況觀察

空白組大鼠精神狀態良好,靈活喜動,攝食攝水及二便正常,毛發光澤柔順。造模操作后,模型組、針刺治療組、針刺對照組及藥物對照組大鼠均見精神不振,狀態萎靡,攝食攝水量較前明顯減少,體質量下降,部分大鼠大便溏薄,毛色無光,容易脫落。隨著治療進行,針刺治療組、藥物對照組大鼠精神狀態逐漸改善,攝食攝水量及體質量穩定增加,毛發逐漸恢復光澤,便溏表現逐漸好轉。針刺對照組大鼠一般情況雖較模型組有所改善,但改變不及針刺治療組、藥物對照組明顯。

2.2 5組大鼠胃黏膜UI值比較

與空白組比較,模型組大鼠胃黏膜UI值明顯升高(P＜0.01)。與模型組比較,針刺治療組和藥物對照組大鼠胃黏膜 UI值明顯降低(P＜0.01),針刺對照組胃黏膜UI值雖較模型組有所降低,但差異無統計學意義(P＞0.05)。針刺治療組大鼠胃黏膜UI值明顯低于針刺對照組(P＜0.01)。詳見圖1。

圖1 5組大鼠胃黏膜UI值比較

2.3 5組大鼠胃黏膜形態學觀察

光鏡下可見,空白組大鼠胃黏膜上皮結構清晰,黏膜腺體排列規整,未見炎細胞浸潤;模型組大鼠與空白組比較胃黏膜損傷明顯,黏膜下層充血水腫、炎性細胞浸潤,黏膜上皮細胞壞死,可見深層黏膜破壞;經治療后,針刺治療組與藥物治療組大鼠黏膜下層水腫明顯減輕,未見明顯炎性細胞浸潤及黏膜組織破壞;針刺對照組大鼠黏膜下層可見輕度水腫和炎細胞浸潤,黏膜上皮和深層破壞較模型組減輕。詳見圖2。

圖2 大鼠胃黏膜組織病理形態學改變

2.4 5組大鼠血清EGF、TGF-α含量比較

模型組大鼠血清EGF、TGF-α的含量較空白組明顯降低(P＜0.01)。與模型組比較,針刺治療組、藥物對照組血清 EGF、TGF-α的含量明顯升高(P＜0.05,P＜0.01)。針刺對照組大鼠血清中EGF、TGF-α含量較模型組有所升高,但差異無統計學意義(P＞0.05)。針刺治療組對血清EGF、TGF-α水平的改善明顯優于針刺對照組(P＜0.05)。詳見表1。

表1 5組大鼠血清EGF、TGF-α含量比較 (±s,pg/mg)

表1 5組大鼠血清EGF、TGF-α含量比較 (±s,pg/mg)

注:與空白組比較 1)P＜0.01;與模型組比較 2)P＜0.05,3)P＜0.01;與針刺對照組比較4)P＜0.05

組別 n EGF TGF-α空白組 10 3.63±1.08 13.50±2.36模型組 10 0.68±0.541) 5.75±1.261)針刺治療組 10 1.59±0.851)2)4) 9.83±1.121)3)4)藥物對照組 10 1.62±0.891)2) 9.44±2.011)3)針刺對照組 10 0.92±0.461) 7.02±1.541)

2.5 5組大鼠胃黏膜組織pMEK、pERK蛋白水平比較

模型組大鼠胃黏膜組織中pMEK、pERK的蛋白表達較空白組顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較,針刺治療組、藥物對照組大鼠胃黏膜組織中pMEK、pERK的蛋白表達均明顯增高(P＜0.01)。針刺對照組的表達較模型組有所增高,但差異無統計學意義(P＞0.05)。針刺治療組大鼠pMEK、pERK蛋白表達明顯高于針刺對照組(P＜0.01)。詳見圖3。

圖3 5組大鼠胃黏膜組織中pMEK、pERK蛋白水平比較

2.6 5組大鼠胃黏膜組織ZO-1、Occludin蛋白水平比較

模型組大鼠胃黏膜組織中ZO-1、Occludin的蛋白表達較空白組明顯降低(P＜0.01)。針刺治療組、藥物對照組與模型組比較,ZO-1、Occludin的表達明顯升高(P＜0.01)。針刺對照組ZO-1、Occludin的表達較模型組有所升高,但差異無統計學意義(P＞0.05)。針刺治療組大鼠ZO-1、Occludin的蛋白表達明顯高于針刺對照組(P＜0.01)。詳見圖4。

圖4 5組大鼠胃黏膜組織ZO-1、Occludin蛋白水平比較

3 討論

應激性胃潰瘍(stress gastric ulcer,SGU)是指機體在創傷、燒傷、休克、寒冷等各種應激狀態下所出現的一種急性胃黏膜病變,臨床一般表現為胃底和胃體部黏膜表淺潰瘍、糜爛或出血[1]。隨著經濟、科技水平不斷提高,人們的心理壓力逐漸增大,導致 SGU的發病率逐年增長。如今,奧美拉唑等質子泵抑制劑(PPIs)已廣泛應用于SGU的治療,但長期服用PPIs可導致胃黏膜屏障功能受損,腸道菌群紊亂等不良反應,還能影響維生素C、維生素B12的吸收,增加胃癌與血液相關疾病的發病幾率[9]。近年來,針刺及電針經大量臨床和實驗研究證實,治療 SGU療效確切,且具有經濟、毒副作用小的優勢[2]。

將六腑的下合穴與本經募穴配合使用,以治療六腑病證的配穴方法稱為“合募配穴”[10]。下合穴主治內腑,偏于通降,募穴亦偏重于內腑或陽經病邪,合募配合,可起到升降相合,調暢氣機的作用。《內經》中首次提出“合治內腑”,《難經·六十七難》提出“陽病行陰,故令募在陰”的理論,使“合募配穴”成為針灸治療腑病的重要指導思想[11]。足三里為足陽明胃經的合穴,胃腑的下合穴,為治療胃腑疾患的首選穴。中脘為胃之募穴,亦善治臟腑病變。中脘及足三里配合能夠促進胃氣生成及運行,調理中焦,調暢氣機及運脾化濕,治療SGU臨床應用廣泛,療效顯著[12]。徐小茹等[13]分析總結了近10年針灸治療SGU的取穴規律,發現取穴以四肢部位為主,以胸腹部為輔,其中足三里與中脘合募配穴的應用頻次占54.54%。

經穴主治的特異性是針刺療法應用的依據和基礎,也是其發揮療效的關鍵因素。人體的主要穴位區微血管、神經分支豐富,多沿經脈循行走行。針刺刺激經穴與非穴區,作用有明顯差異[14]。本實驗通過束縛-冷應激法制備大鼠 SGU模型,觀察中脘、足三里“合募配穴”對SGU的治療作用,并設立針刺對照組,觀察針刺經穴與非經穴的療效差異。實驗結果得出,中脘、足三里針刺治療能夠降低 UI值,改善大鼠胃黏膜損傷,且治療效果明顯優于針刺對照組。提示中脘、足三里配合能夠促進 SGU損傷胃黏膜的修復,其經穴效應具有特異性。表皮生長因子(EGF)是一種單鏈多肽物質,廣泛分布于人體多種組織,具有抑制胃酸分泌,促進上皮細胞增殖的作用,并能保護胃黏膜免受損傷因子的破壞[15]。轉化生長因子α(TGF-α)是EGF家族中的一種具有調節胃黏膜損傷后修復作用的主要調節肽,能夠通過自分泌促進上皮細胞、內皮細胞等多種細胞的有絲分裂,調節壁細胞酸分泌功能,維持胃黏膜完整性[16]。本實驗中,模型組大鼠血清EGF和TGF-α水平最低,針刺治療組大鼠EGF、TGF-α的水平隨其癥狀的改善而明顯升高,提示針刺中脘、足三里能夠促進SGU大鼠內源性 EGF、TGF-α的合成與釋放,參與胃黏膜細胞增殖及黏膜結構的重建,從而促進SGU愈合。

另一方面,EGF和TGF-α通過與表皮生長因子受體(EGFR)相互作用,能引起兩個及多個受體聚集,使酪氨酸激酶活化,激活絲裂原活化蛋白激酶(MEK)/胞外信號調節激酶(ERK)途徑[17]。活化的MEK/ERK可調節胃黏膜上皮細胞的增殖、分化和凋亡,參與胃炎、胃潰瘍的發生,及胃黏膜的防御與修復過程[18]。本實驗選擇MEK/ERK通路作為研究指標,觀察針刺中脘、足三里對其相關蛋白表達的調控作用。結果可見,與模型組比較,針刺治療組可顯著上調大鼠胃黏膜pMEK和pERK的表達,提示針刺中脘、足三里參與SGU胃黏膜修復的機制可能與激活MEK/ERK通路相關。此外,MEK/ERK通路可通過調節閉合蛋白(Occludin)和緊密粘連蛋白-1(ZO-1)的表達來維持胃黏膜緊密連接,恢復胃黏膜屏障功能[19]。研究[20]表明,ERK特異性抑制劑干預后,pERK的表達降低,ZO-1的表達隨之降低。MEK/ERK信號通路激活,則 ZO-1的表達增加,從而促進了胃黏膜的修復。YANG R等[21]發現,阻斷ERK1/2的磷酸化進程,則ZO-1、Occludin的表達顯著下調。機體在應激狀態下,胃黏膜屏障功能受到破壞,細胞間緊密連接結構受損,細胞間通透性增加,導致胃黏膜損傷[21]。在本實驗中,模型組大鼠胃黏膜ZO-1和Occludin的表達均明顯降低,提示胃黏膜上皮屏障功能損傷,黏膜防御功能下降。中脘、足三里針刺治療顯著增加了 ZO-1和Occludin的表達,從而使大鼠胃黏膜屏障功能得到有效恢復,減輕了黏膜病理損傷,與病理染色結果一致。針刺治療組對以上指標的改善效果均優于針刺對照組,同樣說明了中脘、足三里經穴效應的特異性。

綜上所述,中脘、足三里“合募配穴”治療 SGU療效明確,其機制可能與激活MEK/ERK信號通路,促進細胞生長因子及緊密連接蛋白的表達相關。