外源5-ALA對干旱脅迫下玉米幼苗生長的緩解效應及抗氧化酶基因表達的影響

王 鵬，楊奧軍，馮志進，王 婷，金梓浩，王 芳，彭云玲

(甘肅農業大學農學院，甘肅 蘭州 730070)

玉米(ZeamaysL.)是我國重要的糧飼兼用作物，其中北方春播玉米作為我國玉米生產的重要組成部分，對我國玉米總產量有著突出貢獻。干旱是玉米豐產的重要制約因素，而北方春季降雨量少，水汽蒸發速率高，導致干旱對北方春播玉米造成了極其惡劣的影響[1]。尤其是玉米苗期，對水分的敏感程度較大，一旦遭受干旱脅迫，幼苗的生長就會受到嚴重影響，并導致幼苗在生理生化和代謝方面發生一系列變化。研究表明，外源植物生長調節劑(Plant growth regulator，PGR)具有緩解生物、非生物脅迫對植物造成傷害的作用，可通過調控植物體內多個生理生化進程直接或間接地提高植物的抗性，因此，探索潛在的生長調節物質及其調控機理對提高植物抗逆性具有非常重要的意義[2]。

5-ALA是四氫吡咯的前綴化合物，是生物體合成葉綠素、血紅素、維生素B12等必不可少的物質，是一種潛在的生理活性物質[3]，現已證實其對干旱、鹽、高溫、低溫、重金屬和紫外輻射等多種非生物脅迫具有一定的緩解效應[4]。Watanabe等[5]研究發現5-ALA能夠促進高鹽分條件下棉花植株的生長；Balestrasse等[6]和Wang等[7]研究發現外源5-ALA能夠提高低溫脅迫下大豆幼苗弱光和低溫脅迫下甜瓜幼苗中的葉綠素含量；張春平等[8]研究發現使用100 mg·L-1的5-ALA處理遭受干旱脅迫的草珊瑚，不僅葉片中葉綠素含量顯著提高，葉綠素熒光參數也有所提高。5-ALA對干旱脅迫下玉米幼苗生長的緩解效應及其相關抗氧化酶基因表達的研究鮮有報道，因此，本試驗在15%PEG-6000處理模擬的干旱脅迫下，研究噴施外源5-ALA對干旱脅迫下玉米幼苗生長、活性氧代謝、葉綠素含量、光合能力及抗氧化酶基因表達的影響，明確5-ALA對干旱脅迫下玉米幼苗生長的調節作用，為5-ALA調控玉米幼苗的抗旱機理的研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

抗旱玉米自交系鄭58和干旱敏感自交系TS141。

1.2 試驗方法

挑選飽滿、大小一致的玉米種子，用1%的NaClO溶液消毒10 min，使用蒸餾水沖洗多次，直到NaClO溶液味道消失為止，浸種24 h。在每個裝滿蛭石的塑料花盆(長×寬×高：15 cm×13 cm×11 cm)中分別播種10粒種子，放入人工智能氣候培養箱內進行培養，其培養條件為光照14 h，黑暗10 h，溫度為25℃/20℃，光照強度為500 μmol·m-2·s-1，相對濕度為60%。每隔2 d使用1/5濃度的Hoagland營養液澆灌1次。待玉米幼苗生長至三葉一心期進行試驗處理。CK，正常澆水+葉片噴施蒸餾水；ALA，正常澆水+葉片噴施5-ALA；PEG,干旱脅迫+葉片噴施蒸餾水；AP,干旱脅迫+葉片噴施5-ALA。

根據前期的試驗結果，本試驗中選用15% PEG-6000模擬干旱脅迫，5-ALA噴施濃度選用25 mg·L-1。CK和PEG處理組玉米葉片噴施蒸餾水，ALA和AP處理組玉米葉片噴施5-ALA，連續處理3 d，同時PEG和AP處理組每隔2 d使用100 mL 15% PEG-6000的Hoagland營養液澆灌進行干旱脅迫處理，CK和ALA處理組每隔2 d使用等量的1/5濃度的Hoagland營養液澆灌處理。試驗每個處理重復3次。脅迫處理1周后取樣，液氮處理后-70℃保存，用于生理指標和基因表達量的測定。

1.3 試驗指標及測定方法

1.3.1 玉米幼苗生長指標的測定 苗長的測定：第8天每個處理選取10株幼苗用直尺測量幼苗莖基部至頂端生長點的長度。幼苗鮮、干重的測定：每個處理選取10株幼苗，用蒸餾水沖洗干凈，并用濾紙吸干表面殘余水分，稱量鮮重，隨后將其置于烘箱內，105℃殺青30 min，80℃烘干至恒重后稱量其干重。

1.3.2 玉米幼苗生理指標的測定 H2O2含量采用分光光度法測定[9]，MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法測定[9]，SOD活性采用光化學還原法測定[10]，POD活性采用愈創木酚比色法測定[10]，CAT活性采用紫外吸收法測定[10]，APX活性采用比色法測定[10]。

1.3.3 玉米幼苗葉綠素含量的測定 使用便攜式葉綠素測定儀測定。

1.3.4 玉米幼苗氣體交換參數測定 測定之前將玉米植株在自然光照條件下進行光適應至少10 min，使用LI-6400便攜式光合儀測定葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和胞間CO2濃度(Ci)。

1.3.5 玉米幼苗葉片上表皮氣孔觀察 參照Yu等[11]葉片表面壓印法，選取不同處理下玉米幼苗第三片功能葉中間部位(1 cm×1 cm)，制作葉片上表皮切片，每個處理3個重復，然后置于LEICA DM 500光顯微鏡，在10×10倍鏡下觀察氣孔形態，并隨機選取6個視野拍照，然后利用Image-Pro Plus 6.0軟件統計單位面積氣孔數量，并測量氣孔寬度和長度。

1.3.6 抗氧化酶基因表達分析

(1)熒光定量特異性引物設計。以Actin基因為內參基因，采用實時定量PCR技術，檢測3種抗氧化酶基因SOD3、POD3、CAT1的mRNA水平。引物由上海生工有限公司合成,各目的基因引物序列見表1。

表1 抗氧化酶基因和內參基因的引物序列Table 1 Primer sequences of antioxidant enzyme gene and internal reference gene

(2)總RNA的提取及反轉錄。總RNA的提取：按照Steady Pure植物RNA提取試劑盒(艾科瑞，AG)說明書提取，使用BioBnMATEr5超微量紫外分光光度計測定濃度和純度，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量。

按照Evo M-MLV反轉錄試劑預混液(艾科瑞，AG)說明書進行反轉錄，在無菌無酶的離心管中加入4 μL的5×Evo M-MLVRT Master Mix，RNA的量根據提取的濃度稀釋后加入，添加RNase free water至20 μL的體系，混勻、離心。按照第一階段37℃ 15 min，第二階段85℃ 5 s，4℃保存的反應條件進行反轉錄，得到單鏈cDNA 于-20℃保存備用。

(3)熒光定量PCR(Real-Time PCR)。Real-Time PCR采用2×SYBR Mixture(Biomiga)熒光定量試劑盒。采用Step One Plus實時PCR系統(Applied bio-systems, CA, 美國)進行熒光定量PCR擴增，反應體系見表2。反應條件：95℃預變性30 s， 95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，循環40次，每個樣品3次重復。

表2 qPCR反應體系Table 2 qPCR reaction system

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0對所得數據進行統計和多重比較分析。基因的表達量采用2-ΔΔCT相對定量的方法，對不同處理玉米葉片抗氧化酶基因表達量進行數據分析。各指標試驗數據均采用3次重復。

2 結果與分析

2.1 外源5-ALA對干旱脅迫下玉米幼苗苗長、鮮重及干重的影響

由表3可知，噴施5-ALA后，自交系鄭58的苗長、幼苗鮮重、幼苗干重與對照(CK)差異不顯著，而TS141與對照相比，苗長沒有顯著差異，幼苗干鮮重卻有顯著差異。在PEG處理下，與對照(CK)相比，鄭58和TS141玉米幼苗的苗長、鮮重、干重都顯著降低，鄭58分別下降18.49%、29.06%和20.00%， TS141分別下降25.66%、23.97%和13.64%；與PEG處理相比，AP處理下的鄭58和TS141幼苗的苗長、鮮重和干重都有增加，苗長分別增加了13.31%和11.21%，幼苗鮮重分別增加了22.29%和18.23%，幼苗干重分別增加了16.67%和10.53%。表明噴施5-ALA能夠有效緩解干旱脅迫對玉米幼苗苗長、鮮重和干重的抑制作用。

表3 不同處理下玉米幼苗苗長、鮮重及干重Table 3 Seedling length, fresh weight and dry weight of maize seedlings under different treatments

2.2 外源5-ALA對干旱脅迫下玉米幼苗丙二醛和H2O2含量的影響

由圖1可知，與對照(CK)相比，ALA處理下鄭58幼苗葉片的MDA及H2O2含量變化不顯著，TS141幼苗葉片中MDA及H2O2含量呈下降趨勢；PEG處理下，與對照相比，鄭58和TS141幼苗葉片中MDA及H2O2含量都顯著提高，MDA含量分別提高了164.58%、263.53%，H2O2分別提高了134.95%、203.83%。干旱脅迫下噴施5-ALA后(AP處理)，與PEG處理相比，鄭58和TS141幼苗葉片中MDA及H2O2含量顯著降低，MDA分別降低了17.85%、25.39%，H2O2分別降低了23.26%、19.15%。說明5-ALA能顯著抑制干旱脅迫下玉米幼苗葉片中MDA及H2O2含量的提高，減緩活性氧的積累。

圖1 外源5-ALA對干旱脅迫下兩個玉米自交系丙二醛(MDA)和過氧化氫(H2O2)含量的影響Fig.1 Effect of exogenous 5-ALA on MDA and H2O2 content of two maize inbred lines under drought stress

2.3 外源5-ALA對干旱脅迫下玉米幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖2以看出，與對照(CK)相比，ALA處理下鄭58和TS141玉米幼苗葉片中的SOD、POD、CAT和APX活性變化不顯著。PEG處理下幼苗葉片中的4種酶活性都顯著升高，與對照相比，鄭58分別提高了65.61%、29.48%、68.49%、141.51%，TS141分別提高了63.01%、48.00%、85.68%、204.29%。與PEG處理相比，AP處理下的幼苗葉片中的4種酶活性顯著增加，鄭58分別增加16.49%、18.15%、36.98%和28.13%，TS141分別增加16.65%、16.54%、28.49%和26.76%。這說明噴施5-ALA能夠提高玉米幼苗葉片中抗氧化酶的活性，緩解玉米的干旱脅迫程度。

圖2 外源5-ALA對干旱脅迫下兩個玉米自交系抗氧化酶活性的影響Fig.2 Effect of exogenous 5-ALA on antioxidant enzyme activity of two maize inbred lines under drought stress

2.4 外源5-ALA對干旱脅迫下玉米幼苗葉綠素含量的影響

由圖3可知，與對照(CK)相比，在ALA處理下，鄭58和TS141玉米幼苗葉片中葉綠素含量均顯著增加；PEG處理下，鄭58玉米葉片中葉綠素含量比對照降低了33.46%，TS141比對照降低了42.26%；與PEG處理相比，AP處理下鄭58玉米葉片葉綠素含量增加18.29%，TS141增加19.87%。說明噴施5-ALA能有效緩解干旱脅迫下玉米葉片中葉綠素含量的下降，并且對TS141的緩解效應更顯著。

圖3 外源5-ALA對干旱脅迫下兩個玉米自交系葉綠素含量的影響Fig.3 Effect of exogenous 5-ALA on chlorophyll content of two maize inbred lines under drought stress

2.5 外源5-ALA對干旱脅迫下玉米幼苗光合特性的影響

由圖4可以看出，PEG處理下，玉米幼苗葉片光合參數Pn、Gs、Tr明顯降低，與CK相比，鄭58的Pn、Gs、Tr分別下降48.78%、45.31%、52.39%，TS141的Pn、Gs、Tr分別下降57.66%、57.46%、65.14%；PEG處理下鄭58的光合參數Ci與對照相比下降56.08%， TS141下降不顯著；與PEG處理相比，噴施5-ALA的玉米幼苗葉片光合參數的下降得到了明顯緩解，AP處理下鄭58的Pn、Gs、Ci、Tr分別上升了35.87%、36.63%、51.21%、37.67%，TS141的Pn、Gs、Tr分別上升了42.12%、36.81%、67.88%，而TS141中的Ci與PEG處理相比下降23.79%。表明5-ALA能夠提高干旱脅迫下玉米幼苗光合作用效率。

圖4 外源5-ALA對干旱脅迫下兩個玉米自交系光合特性的影響Fig.4 Effects of exogenous 5-ALA on photosynthetic characteristics of two maize inbred lines under drought stress

2.6 外源5-ALA對干旱脅迫下玉米幼苗葉片上表皮氣孔的影響

從圖5和圖6可以看出，正常情況下，耐旱自交系鄭58葉片上表皮單位面積氣孔數量大于旱敏感自交系TS141，氣孔長度和寬度鄭58小于TS141。ALA處理下兩個自交系葉片上表皮單位面積氣孔數量、長度和寬度變化都不明顯。PEG處理下兩個玉米自交系葉片上表皮單位面積氣孔數量顯著增加，氣孔長度和寬度均顯著減小，耐旱自交系鄭58葉片上表皮單位面積氣孔數量與對照相比增加了39.64%，氣孔長度和寬度分別減小了22.48%和26.39%，而旱敏感自交系TS141葉片上表皮單位面積氣孔數量增加了28.72%，氣孔長度和寬度分別減小了15.88%和23.08%，鄭58葉片上表皮單位面積氣孔數量的增幅、氣孔長度和寬度的減幅都遠大于TS141。噴施外源5-ALA后對干旱脅迫下氣孔特性有明顯的緩解效應，鄭58葉片上表皮單位面積氣孔數量與PEG處理相比減少12.90%，氣孔長度和寬度分別增加16.04%和21.49%，而TS141葉片上表皮單位面積氣孔數量與PEG處理相比減小16.53%，氣孔長度和氣孔寬度分別增大了11.19%和11.97%。

圖5 不同處理下兩個玉米自交系幼苗葉片上表皮氣孔顯微結構Fig.5 Stomatal microstructure of upper epidermis of two maize inbred lines seedlings under different treatments

圖6 不同處理對兩個玉米自交系幼苗葉片上表皮氣孔參數的影響Fig.6 Effects of different treatments on stomate of seedling leaves of two maize inbred lines

2.7 外源5-ALA對干旱脅迫下玉米幼苗抗氧化酶基因相對表達含量的影響

SOD3、POD3、CAT1分別是抗氧化酶SOD、POD、CAT的關鍵調控基因。由圖7可知， ALA處理下玉米自交系鄭58和TS141的SOD3、POD3、CAT1相對表達量與對照相比沒有顯著變化。在PEG處理下，2個玉米自交系幼苗葉片中抗氧化酶基因SOD3、POD3、CAT1相對表達量較CK都有顯著提高，鄭58分別提高54.58%、34.12%、69.70%，TS141分別提高54.95%、21.36%、59.34%；AP處理進一步提高了抗氧化酶基因SOD3、POD3和CAT1的相對表達量，鄭58分別提高20.99%、32.18%和23.51%，TS141分別提高25.97%、23.16%和40.94%。這說明噴施5-ALA能夠提高抗氧化酶基因SOD3、POD3、CAT1的相對表達量。

圖7 不同處理下玉米幼苗抗氧化酶基因表達量Fig.7 Expression of antioxidant enzyme genes in maize seedlings under different treatments

3 討 論

植物幼苗階段是受干旱脅迫影響最為嚴重的時期，與其他作物相比較，玉米前期生長相對緩慢，如果水分供應不及時，玉米的整個生長發育將會受到嚴重影響[12]。因此，緩解玉米幼苗期的干旱脅迫是提高玉米產量和質量的重要途徑。本研究發現，抗旱玉米自交系鄭58和干旱敏感自交系TS141在干旱脅迫下幼苗的生長明顯受到抑制。噴施5-ALA處理后，玉米幼苗的苗長、鮮重和干重都得到提高，說明5-ALA能夠促進干旱脅迫下玉米幼苗的生長，而且對抗旱自交系鄭58的緩解效應好于干旱敏感自交系TS141。這與孫陽等[13]對低溫脅迫下玉米幼苗生長的緩解效應研究結果一致。

膜質過氧化產物MDA能很好地反映植物膜系統的受損程度，干旱脅迫下MDA和H2O2含量顯著提高，說明玉米幼苗受到干旱脅迫后膜系統損傷，導致膜質過氧化產物MDA含量增加。噴施5-ALA后，MDA和H2O2含量明顯降低，表明施加5-ALA可以降低玉米幼苗中MDA和H2O2的含量，減緩活性氧的積累，弱化對玉米幼苗的毒害作用。這與Li等[14]在黃瓜上的研究和Liu等[15]在油菜上的研究結果相似。

正常情況下植物體內的活性氧水平處于一種動態平衡，而干旱脅迫會破壞這種平衡，造成植物體內的ROS過多，引發脂質過氧化、蛋白質氧化等一系列毒害植物體的過程[16]。植物將通過提高抗氧化酶的活性來消除過多的活性氧，降低其對植物的毒害作用。SOD、POD、CAT和APX是植物體內重要的抗氧化酶，干旱脅迫下玉米幼苗葉片中SOD、POD、CAT和APX活性顯著高于對照，說明植物在受到干旱脅迫后通過提高4種抗氧化酶的活性，清除體內多余的ROS，緩解干旱損傷，提高抗旱能力。噴施5-ALA 后，玉米幼苗葉片中4種酶活性得到進一步提高，說明5-ALA能增強抗氧化酶的活性，從而提高玉米幼苗抗氧化、抗衰老的能力，緩解干旱脅迫對玉米幼苗的毒害作用。安玉艷等[17]研究發現外源5-AlA通過降低春茶的氧化損傷，提高抗氧化酶活性來提高春茶的產量和品質。

葉綠素是植物光合作用過程中必不可少的一部分，當植物體內的光合色素過少或者光合作用強度不夠時，可以適當噴施5-ALA來提高葉綠素的含量。本研究表明，干旱脅迫下玉米植株葉綠素含量顯著降低，植物光合作用減弱，有機物的積累減少。在5-ALA處理下，玉米植株葉綠素含量得到顯著提高，光合作用增強，有機物的積累增加。王嘉楠等[18]研究發現噴施外源5-ALA能夠明顯增加葉綠素含量，緩解干旱脅迫下小麥幼苗葉片的光合能力，從而提高小麥幼苗的耐旱性。李瑞杰等[19]研究發現5-ALA能提高東北春玉米葉綠素含量。植物光合作用的強度主要通過光合參數來反映。在干旱脅迫下，鄭58和TS141幼苗葉片光合參數Pn、Gs、Tr顯著降低，光合作用效率下降，噴施5-ALA后，玉米幼苗葉片光合參數Pn、Gs、Tr的下降得到緩解。導致光合作用效率下降的原因有氣孔因素和非氣孔因素，耐旱自交系鄭58的Gs降低，Ci也降低，說明氣孔因素是限制鄭58光合速率下降的主要原因；干旱敏感自交系TS141的Gs降低，而Ci升高，說明后期植物光合速率下降的主要原因是由非氣孔因素導致，噴施5-ALA可以緩解干旱脅迫對玉米幼苗葉片光合作用效率的抑制。王發展等[20]研究發現5-ALA能提高烤煙幼苗葉綠素含量和光合參數Pn、Gs、Tr，從而緩解干旱脅迫對烤煙的傷害，提高烤煙的抗旱能力。

植物葉片氣孔作為植物體與大氣環境氣體交換的重要結構，為了適應干旱脅迫氣孔形態特征通常會發生一系列變化[21]。有研究發現，在植物應對逆境脅迫的過程中，葉片氣孔密度增加和氣孔減小對環境變化的響應更為迅速[22-23]。本研究發現，在干旱脅迫處理下，干旱敏感自交系TS141葉片上表皮單位面積氣孔數量遠小于耐旱自交系鄭58，而氣孔長度和寬度大于耐旱自交系鄭58。說明耐旱性較強的玉米自交系其葉片氣孔個體小且分布緊密，玉米為了適應干旱脅迫，氣孔減小防止水分蒸發，葉片生長受到抑制，從而使葉片面積減小，導致單位面積氣孔數量上升，這與王凱麗等[24]在棉花中的研究結果一致。另外干旱脅迫下耐旱自交系鄭58氣孔參數變化幅度大于干旱敏感自交系TS141，可能是鄭58耐旱性比TS141強的原因，這說明耐旱性越強的材料氣孔在面對干旱脅迫時做出應激反應越強，外源噴施5-ALA對干旱脅迫下2個玉米自交系都有不同程度的緩解作用。

抗氧化酶SOD、POD、CAT的含量及其表達活性受相應基因的調控。干旱脅迫下，抗氧化酶基因SOD3、POD3、CAT1的相對表達含量顯著提高，從而提高抗氧化酶SOD、POD、CAT的表達活性，加快對過量ROS的清除。噴施5-ALA后，抗氧化酶基因SOD3、POD3、CAT1的相對表達含量增加，玉米幼苗的抗旱性增強。

4 結 論

綜上所述，干旱脅迫下玉米幼苗生長明顯受到抑制，幼苗葉片中MDA、H2O2含量以及抗氧化酶活性顯著提高，葉片中葉綠素含量以及光合參數明顯下降，抗氧化酶基因相對表達量明顯提高。噴施25 mg·L-1的5-ALA，玉米幼苗的苗長等形態指標、葉綠素含量以及光合參數得到明顯提高，葉片中MDA、H2O2含量明顯下降，SOD等4種抗氧化酶活性以及抗氧化酶基因相對表達量得到進一步提高，從而提高玉米幼苗的抗旱性。