黃瓜嫁接苗與接種哈茨木霉菌黃瓜直根苗對(duì)根腐病防效及根系生理響應(yīng)

靳亞忠,熊亞男,齊 娟,劉蕾慶,任金立,李春霞 ,盧美燕,陳 慧,陳泳池

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江 大慶 163319; 2.青島金媽媽農(nóng)業(yè)科技有限公司，山東 青島 266000)

黃瓜(CucumissativusL.)是重要的葫蘆科蔬菜作物，為人類(lèi)飲食提供了營(yíng)養(yǎng)元素和食用纖維，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，尤其是設(shè)施生產(chǎn)中占有重要地位[1]，但設(shè)施黃瓜連作栽培造成黃瓜根腐病發(fā)生較為嚴(yán)重[2]。目前，世界范圍內(nèi)黃瓜栽培主要依賴(lài)于嫁接栽培提高黃瓜對(duì)非生物脅迫、土傳病害及線蟲(chóng)的抗性，以達(dá)到優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的目的[3-4]。黃瓜根腐病是由茄鐮刀菌瓜類(lèi)專(zhuān)化型(Fusariumsolanif.sp.cucurbitaeSnyder et Hansen)[5]、腐霉菌(Pythiumultimum)[6]、瓜類(lèi)疫霉菌(Phytophthoramelonis)[7]、辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)[8]引起的一種根部病害。嫁接栽培可以提高瓜菜抗生物和非生物脅迫性能以及肥水利用，減少農(nóng)藥投入量，是黃瓜栽培中一種綠色、安全生產(chǎn)的重要方法。在番茄[9]、辣椒[10-11]、西瓜[12]、甜瓜[13]等研究中，利用嫁接栽培明顯地控制了根腐病的發(fā)生，得到了種植者廣泛認(rèn)可。但是，近年來(lái)，我國(guó)的山東、遼寧、內(nèi)蒙古等地設(shè)施栽培黃瓜根腐病發(fā)生嚴(yán)重，發(fā)生率高達(dá)20%～30%[14-15]，可能與選擇使用的南瓜砧木以及砧木與接穗組合搭配對(duì)根腐病的抗性有關(guān)[12]。雖然嫁接栽培能促進(jìn)黃瓜生長(zhǎng)和提高黃瓜抗土傳病害能力，但是黃瓜的可溶性糖和香味品質(zhì)明顯降低[16]，暗示了嫁接黃瓜品質(zhì)的維持與抗病性的提高主要依賴(lài)于適宜砧木和接穗組合選擇[17-18]。此外，在生產(chǎn)中，蔬菜嫁接栽培的應(yīng)用還存在嫁接苗的生產(chǎn)成本、種苗管理以及運(yùn)輸成本等較高的現(xiàn)象[19]。前人研究表明，作物根腐病的防治主要采用化學(xué)藥劑進(jìn)行土壤消毒[5,20-21]和田間灌根處理的方法[22-26]，但是化學(xué)農(nóng)藥在殺死病原菌的同時(shí)也殺滅了土壤中的有益菌，不利于可持續(xù)生產(chǎn)。因此，在蔬菜生產(chǎn)中，采用微生態(tài)理論指導(dǎo)生產(chǎn)是一種綠色、優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)的方向，同時(shí)也能降低蔬菜育苗及生產(chǎn)的成本[27]，且利用有益微生物或拮抗微生物抑制土傳病害病原物的生長(zhǎng)，以控制土傳病害的發(fā)生，已經(jīng)在黃瓜和甜菜[1,6，8]、蠶豆[28]、木薯[29]、油豆角[30]、藍(lán)莓[31]、木香[32]、煙草[33]、大蒜[34]以及大豆[35]等作物栽培中得到驗(yàn)證。在黃瓜根腐病防治的研究中，假單胞菌(Pseudomonas)和芽孢桿菌(Bacillus)菌株[6,8]、哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)和淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)菌株[36]以及拮抗鐮孢菌(Fusarium)菌株[37]能有效抑制根腐病病原菌生長(zhǎng)及根腐病的發(fā)生，且防效與化學(xué)藥劑的防效相當(dāng)[36]。此外，在田間試驗(yàn)中，木霉菌與芽孢桿菌混合菌劑[1]、木霉菌及芽孢桿菌生物有機(jī)肥[15]及綠色木霉菌與草炭復(fù)配基質(zhì)[2]的使用能明顯地降低黃瓜根腐病的發(fā)病率。

嫁接栽培與木霉菌的使用都能提高瓜菜作物的抗病性以及發(fā)揮促生的作用，但是二者作用的效果及生理調(diào)節(jié)機(jī)理是否相同還不明確。研究表明，木霉菌接種植物后會(huì)誘導(dǎo)植物體內(nèi)抗病相關(guān)酶的活性增加及抗逆基因表達(dá)，激發(fā)自身的抗性反應(yīng)，從而減輕病害的發(fā)生[1]。此外，木霉菌產(chǎn)生的效應(yīng)因子，如絲氨酸蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等會(huì)激活植物信號(hào)傳導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性和植物免疫系統(tǒng)，參與病害防治[38-39]；木霉菌菌株與植物相互作用過(guò)程中產(chǎn)生的代謝物，既可以對(duì)植物病原菌發(fā)揮直接抑制作用，也可以通過(guò)觸發(fā)植物防御系統(tǒng)或增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)來(lái)增加抗性[40]。在嫁接辣椒的研究中，接種根腐病病原菌的條件下，嫁接辣椒植株與砧木根系中可溶性糖、苯丙氨酸裂解酶(PAL)活性、酚類(lèi)物質(zhì)及木質(zhì)素含量顯著高于對(duì)照，暗示了嫁接提高辣椒抗根腐病能力與苯丙烷類(lèi)物質(zhì)代謝有關(guān)[41]；在甜瓜[13]、西瓜[12]和黃瓜[14-15]的研究中也發(fā)現(xiàn)嫁接能提高抗根腐病能力，但嫁接對(duì)其植株根系生理調(diào)節(jié)的研究報(bào)道較少，且是否與木霉菌調(diào)控直根苗抗根腐病的效果及生理調(diào)節(jié)相類(lèi)似，鮮有報(bào)道。因此，本研究采用哈茨木霉菌DQ002與根腐病原菌孢子懸浮液對(duì)黃瓜幼苗進(jìn)行根部接種，通過(guò)對(duì)比木霉菌與根腐病病原菌接種直根苗與病原菌單獨(dú)接種嫁接苗對(duì)根腐病的防效及根系生理變化，探討木霉菌防治黃瓜根腐病效果以及調(diào)控根腐病的生理機(jī)理是否與嫁接苗抗根腐病的效果及調(diào)節(jié)生理相類(lèi)似，所得結(jié)果將為研究木霉菌與植物的互作機(jī)制和推動(dòng)木霉菌的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)基礎(chǔ)，也將為設(shè)施黃瓜進(jìn)行節(jié)本增效生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

采用插接法繁殖的嫁接黃瓜苗以及黃瓜直根苗(強(qiáng)雌性密刺黃瓜6501)，其中嫁接苗的接穗品種為強(qiáng)雌性密刺黃瓜6501，砧木品種為砧大力1989，均由青島金媽媽農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

哈茨木霉菌DQ002，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)園藝園林學(xué)院靳亞忠副教授提供，在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)5～7 d后，用無(wú)菌水洗滌孢子，配制成1×108CFU·mL-1孢子懸浮液，備用。

黃瓜根腐病原菌(Fusariumsolanif. sp.cucurbitaeSnyder et Hansen)，由青島金媽媽農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)5～7 d，用無(wú)菌水洗滌孢子，配制成1×108CFU·mL-1，備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在青島金媽媽農(nóng)業(yè)科技有限公司溫室基地進(jìn)行。采用穴盤(pán)育苗，基質(zhì)為草炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1的混合基質(zhì)，播種前采用1%的次氯酸鈉對(duì)砧木種子和黃瓜接穗種子進(jìn)行消毒，清洗干凈后播種、嫁接。當(dāng)黃瓜直根苗與嫁接苗長(zhǎng)至3葉1心時(shí)，采用根部接種的方式，把哈茨木霉DQ002與根腐病原菌孢子懸浮液接種于黃瓜苗的根部土壤中，每棵幼苗接種5 ml相應(yīng)的孢子懸浮液，木霉菌孢子懸浮液濃度為1×108CFU·mL-1，病原菌孢子懸浮液濃度為1×108CFU·mL-1，接種后進(jìn)行薄膜覆蓋。

試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)處理，分別為CK1，直根苗清水處理； CK2，嫁接苗清水處理； T1，直根苗接種病原菌處理； T2，嫁接苗接種病原菌處理； T3，直根苗先接種病原菌，2 d后接種木霉菌； T4，直根苗先接種木霉菌，2 d后接種病原菌。在接種后的0、2、4、6、8 d進(jìn)行根部樣品采集，每個(gè)處理采集100株黃瓜苗。將幼苗植株洗凈后，分離根部樣品，之后用錫紙包好，做標(biāo)記，于液氮中快速冷凍，并放置于-80℃超低溫冰箱保存，用于生理指標(biāo)的測(cè)定。

在接種根腐病2周后，每個(gè)處理采集100株黃瓜苗記錄病情級(jí)別，計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照賁海燕等[5]的分級(jí)方法，發(fā)病率和病情指數(shù)計(jì)算按照公式：

發(fā)病率=(染病株數(shù)/調(diào)查總數(shù))×100%

病情指數(shù)(DI)=∑(病級(jí)株數(shù)×病級(jí)代表值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高病級(jí)代表值)×100

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel(2010)和SPSS.26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析，Origin 9.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜幼苗根腐病的發(fā)生率及病情指數(shù)

由表1可以看到，直根苗清水處理(CK1)、嫁接苗清水處理(CK2)、直根苗接種病原菌(T1)、嫁接苗接種病原菌(T2)、直根苗先接種病原菌后接種哈茨木霉菌(T3)以及直根苗先接種木霉菌后接種病原菌(T4)發(fā)病率分別為35.82%、23.05%、57.39%、42.90%、22.39%、17.87%，病情指數(shù)分別為37.10%、25.67%、46.97%、40.47%、23.03%、14.33%，且T3和T4處理的黃瓜直根苗根腐病的發(fā)病率則明顯低于CK1、T1和T2處理(P<0.05)，而T3與T4處理間也存在明顯差異，T4處理黃瓜直根苗根腐病的發(fā)病率與病情指數(shù)均明顯低于T3處理(P<0.05)。

表1 黃瓜根腐病調(diào)查T(mén)able 1 Investigation of cucumber root rot

2.2 黃瓜幼苗根系過(guò)氧化物酶(POD)活性

由圖1可以得知，不同處理下黃瓜幼苗根系中POD活性存在差異。在接種培養(yǎng)期間，單獨(dú)接種根腐病病原菌(T1)、先接種病原菌后接種哈茨木霉菌(T3)以及先接種哈茨木霉菌后接種病原菌(T4)處理的黃瓜直根苗根系中POD活性顯著高于CK1(P<0.05)，且T3和T4處理的黃瓜直根苗根系中POD活性也明顯高于T1處理；而在接種培養(yǎng)4 d后，T3處理黃瓜直根苗根系POD活性顯著高于T4處理(P<0.05)(圖1A)。在未接種根腐病原菌的條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移黃瓜嫁接苗(CK2)植株根系中的POD活性顯著高于黃瓜直根苗(CK1)(P<0.05)，但變化規(guī)律相似；而在接種根腐病原菌條件下，黃瓜嫁接苗(T2)根系中的POD活性始終明顯高于未接種處理的CK1、CK2以及T1處理(P<0.05)(圖1B)。此外，由圖1C可以看出，在接種根腐病病原菌條件下，黃瓜嫁接苗(T2)根系中POD活性高于T3和T4處理黃瓜直根苗根系中的POD活性(P<0.05)(接種培養(yǎng)的第4天除外)。

圖1 不同處理下黃瓜幼苗根系過(guò)氧化物酶(POD)活性Fig.1 POD activity of cucumber seedlings roots under different treatments

2.3 黃瓜幼苗根系多酚氧化酶(PPO)活性

由圖2A看出，黃瓜直根苗在接種根腐病病原菌后，T1(單獨(dú)接種病原菌)處理根系PPO活性在接種培養(yǎng)4 d后明顯高于CK1(對(duì)照)處理，但與T3(先接種病原菌后接種哈茨木霉菌)和T4(先接種哈茨木霉菌后接種病原菌)處理相比較，T1處理PPO活性則顯著低于T3和T4處理，而T3和T4處理間無(wú)明顯差異(P<0.05)。由圖2B可以看出，在接種根腐病病原菌條件下，黃瓜嫁接苗(T2處理)根系中PPO活性顯著高于CK1(清水處理黃瓜直根苗)和CK2(清水處理黃瓜嫁接苗)，且在接種后培養(yǎng)的0～6 d期間，T1處理植株根系PPO活性也明顯低于T2(黃瓜嫁接苗)處理(P<0.05)。此外，在接種根腐病病原菌后培養(yǎng)期間，黃瓜嫁接苗(T2)根系PPO活性與T1處理的黃瓜直根苗根系PPO活性?xún)H在培養(yǎng)前期差異明顯(P<0.05)，而T3和T4處理的直根苗根系PPO活性則顯著高于T2(嫁接苗)處理(P<0.05)(圖2C)。

圖2 不同處理下黃瓜幼苗根系多酚氧化酶活性Fig.2 PPO activity of cucumber seedlings roots under different treatments

2.4 黃瓜幼苗根系超氧化物歧化酶(SOD)活性

由圖3A看出，黃瓜直根苗單獨(dú)接種根腐病病原菌的處理(T1)根系中SOD活性明顯大于CK1(清水處理黃瓜直根苗)，顯著低于T3(先接種病原菌后接種哈茨木霉菌)和T4(先接種哈茨木霉菌后接種病原菌)處理直根苗根系SOD活性，而T3和T4處理之間相比，黃瓜直根苗根系中SOD活性?xún)H僅在接種后的0 d和6 d期間存在差異，但都明顯高于CK1處理(P<0.05)。在接種根腐病病原菌后培養(yǎng)2～8 d期間，T2(嫁接苗接種根腐病病原菌)處理的嫁接苗根系中SOD活性明顯高于CK1和CK2(清水處理黃瓜嫁接苗)處理植株根系中SOD活性，而在接種培養(yǎng)的第2～8天期間，T2處理黃瓜嫁接苗根系SOD活性則明顯大于T1處理(P<0.05)；且發(fā)現(xiàn)接種后的第0～6天期間，T1處理黃瓜直根苗根系SOD活性顯著高于CK2處理嫁接苗根系SOD活性(P<0.05)(圖3B)。此外，在接種病原菌條件下，T3處理的黃瓜直根苗根系SOD活性始終顯著高于T2處理(P<0.05)，而T4處理的黃瓜直根苗根系中的SOD活性則在接種培養(yǎng)前期高于T2處理(P<0.05)(圖3C)。

圖3 不同處理下黃瓜幼苗根系超氧化物歧化酶活性Fig.3 SOD activity of cucumber seedlings roots under different treatments

2.5 黃瓜幼苗根系活性氧

圖4 不同處理下黃瓜幼苗根系過(guò)氧化氫(H2O2)含量Fig.4 H2O2 content of cucumber seedlings roots under different treatments

圖5 不同處理下黃瓜幼苗根系超氧陰離子產(chǎn)生速率Fig.5 produce rate of cucumber seedlings roots under different treatments

2.6 黃瓜幼苗根系β-1, 3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性

由圖6、7可以得知，接種后隨著時(shí)間的推移，不同處理的黃瓜幼苗植株根部β-1, 3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶活性變化不同。在接種處理后培養(yǎng)期間，單獨(dú)接種根腐病病原菌(T1)、先接種病原菌后接種哈茨木霉菌(T3)以及先接種木霉菌后接種病原菌(T4)處理下的黃瓜直根苗植株根系中β-1, 3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶活性顯著高于CK1(P<0.05)，而T3和T4處理黃瓜直根苗根系β-1, 3-葡聚糖酶(圖6A)、幾丁質(zhì)酶(圖7A)活性明顯大于T1處理(單獨(dú)接種病原菌)(P<0.05)。未接種病原菌條件下，CK1(清水處理黃瓜直根苗)和CK2(清水處理黃瓜嫁接苗)根系中β-1, 3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶活性之間無(wú)明顯差異(P<0.05)；而單獨(dú)接種病原菌后，在培養(yǎng)的0～2 d期間，T1處理黃瓜直根苗根系中的β-1, 3-葡聚糖酶活性明顯低于T2處理嫁接苗根系中β-1, 3-葡聚糖酶活性(圖6B)，而幾丁質(zhì)酶活性則在培養(yǎng)期間顯著低于T2處理嫁接苗(P<0.05)(圖7B)。此外，還發(fā)現(xiàn)接種根腐病的黃瓜嫁接苗(T2)根部中β-1, 3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶活性明顯高于CK1和CK2處理的β-1, 3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性(P<0.05)。另外，在接種根腐病病原菌條件下，T3和T4處理直根苗根系β-1, 3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶活性則在培養(yǎng)期間始終顯著高于T2處理的黃瓜嫁接苗根系中β-1, 3-葡聚糖酶(第0天除外)、幾丁質(zhì)酶活性(P<0.05)。

圖6 不同處理下黃瓜幼苗根系β-1,3-葡聚糖酶活性Fig.6 β-1,3-glucanase activity of cucumber seedlings roots under different treatments

圖7 不同處理下黃瓜幼苗根系幾丁質(zhì)酶活性Fig.7 Chitinase activity of cucumber seedlings roots under different treatments

2.7 黃瓜幼苗根系苯丙氨酸解氨酶活性

由圖8可以看出，不同處理黃瓜苗根系中苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性之間存在差異。在接種病原菌條件下，根腐病病原菌促進(jìn)了黃瓜直根苗(T1)(圖8A)和黃瓜嫁接苗(圖8B)根系中PAL活性的升高，在培養(yǎng)的第4天呈現(xiàn)峰值，且明顯高于CK1和CK2(P<0.05)。在培養(yǎng)期間，T3(先接種病原菌后接種木霉菌)和T4(先接種木霉菌后接種病原菌)處理的黃瓜直根苗根系中PAL活性顯著高于T1(單獨(dú)接種病原菌的黃瓜直根苗)處理，尤其是在培養(yǎng)的第4天(P<0.05)(圖8A)。此外，在未接種病原菌的條件下，CK1(清水處理)處理的黃瓜直根苗根系PAL活性明顯低于CK2處理(清水處理)的黃瓜嫁接苗；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，接種病原菌后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，T1處理黃瓜直根苗根系中的PAL活性顯著低于T2處理嫁接苗(培養(yǎng)的第4天除外)(P<0.05)(圖8B)，但是T3和T4處理中黃瓜直根苗根系中PAL酶活性顯著高于T2處理嫁接苗，尤其是在培養(yǎng)的第4天，差異顯著(P<0.05)(圖8C)。

圖8 不同處理下黃瓜幼苗根系苯丙氨酸解氨酸酶活性Fig.8 PAL activity of cucumber seedlings roots under different treatments

2.8 黃瓜幼苗根系類(lèi)黃酮含量

由圖9可以看出，黃瓜直根苗和嫁接苗根系中類(lèi)黃酮含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，且在培養(yǎng)的第6天呈現(xiàn)峰值。接種根腐病病原菌促進(jìn)了黃瓜直根苗(T1)和嫁接苗(T2)根系中類(lèi)黃酮含量的增加(圖9B)，顯著高于CK1(清水處理黃瓜直根苗)和CK2(清水處理黃瓜嫁接苗)(P<0.05)；在先接種病原菌后接種木霉菌(T3)和先接種木霉菌后接種病原菌(T4)處理的黃瓜直根苗根系中類(lèi)黃酮含量明顯高于CK1處理，且在培養(yǎng)期間，T3處理黃瓜直根苗根系中類(lèi)黃酮含量顯著大于T1處理，而T4處理黃瓜直根苗根系類(lèi)黃酮含量則在培養(yǎng)的第4天后顯著高于T1處理(圖9A)(P<0.05)。

圖9 不同處理下黃瓜幼苗根系類(lèi)黃酮含量Fig.9 Flavonoid content of cucumber seedlings roots under different treatments

另外，在接種病原菌的條件下，整個(gè)培養(yǎng)期間，T1、T3和T4處理黃瓜直根苗根系中的類(lèi)黃酮含量始終顯著高于T2(單獨(dú)接種病原菌的嫁接苗)處理(P<0.05)(圖9C)。

3 討 論

根腐病是黃瓜栽培中最嚴(yán)重的土傳病害之一，設(shè)施栽培中根腐病發(fā)病尤為嚴(yán)重。目前為止，對(duì)于作物根腐病的防治，生產(chǎn)中多采用化學(xué)藥劑進(jìn)行土壤消毒和根部滴灌的方式[3,22-26]。此外，瓜菜嫁接栽培能明顯降低根腐病的發(fā)病率，是一種有效的防病、促生的栽培方式[13,45-47]；但是由于設(shè)施連續(xù)種植，在黃瓜嫁接栽培中也出現(xiàn)嚴(yán)重根腐病發(fā)生的現(xiàn)象[14-15]。在本研究中，黃瓜嫁接采用的砧木為南瓜砧木(砧大力1989)，嫁接黃瓜能促進(jìn)黃瓜植株生長(zhǎng)和產(chǎn)量增加(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，且未接種根腐病原菌的黃瓜直根苗和嫁接苗根腐病發(fā)生率分別為35.82%和23.05%，而接種根腐病原菌條件下黃瓜直根苗和嫁接苗根腐病的發(fā)病率分別為57.39%和42.90%(表1)，說(shuō)明試驗(yàn)中采用的南瓜砧木雖有一定抗病能力，但也容易感染根腐病病原菌，暗示了該南瓜砧木雖然能促進(jìn)黃瓜生長(zhǎng)，但對(duì)于黃瓜根腐病的抵抗能力具有局限性。作物根腐病防治研究中，發(fā)現(xiàn)利用木霉菌、芽孢桿菌、假單胞菌進(jìn)行種子浸種[6]、包衣[8]、灌根[36-37]或者配制生物有機(jī)肥[15,48]以及微生物復(fù)配菌劑[1,28]等都能明顯控制根腐病的發(fā)生，效果與化學(xué)藥劑對(duì)根腐病的防效相當(dāng)[37]，且蕎麥作物還田通過(guò)調(diào)節(jié)土壤中有益菌群數(shù)量的增加也明顯降低了黃瓜根腐病的發(fā)生[49]。本研究發(fā)現(xiàn)，接種根腐病病原菌后，采用哈茨木霉菌DQ002處理的黃瓜直根苗(T3和T4處理)，其抗根腐病的能力增強(qiáng)，且發(fā)病率分別為22.39%和17.87%，顯著低于CK1和T1處理，說(shuō)明哈茨木霉菌DQ002的使用降低了根腐病的發(fā)生程度，且效果優(yōu)于嫁接黃瓜抗根腐病的能力；先用木霉菌處理黃瓜直根苗(T4)對(duì)根腐病的防治效果優(yōu)于發(fā)病后木霉菌的使用(T3)效果，且哈茨木霉菌DQ002 對(duì)黃瓜直根苗根腐病發(fā)生的控制效果與前人在黃瓜[1,15,36]、藍(lán)莓[31]、木薯[29]上研究結(jié)果一致。

木霉菌發(fā)揮其生物防治活性的途徑之一是提高植物次生代謝物的合成。次生代謝物在木霉菌與植物互作中作為激活子或抗逆誘導(dǎo)子發(fā)揮作用，且抗逆誘導(dǎo)作用發(fā)揮主要是由于抗逆代謝物數(shù)量的增加[56]，這些物質(zhì)包括來(lái)自于苯丙氨酸代謝途徑[41]。TrichodermaharzianumJF419706接種黃瓜幼苗刺激植株體內(nèi)脯氨酸和這總酚含量的升高，提高了黃瓜抗根腐病(Fusariumoxysporiumf. sp.cucumerinumHQ905450轉(zhuǎn)化型根腐病原菌)能力[1]。本研究結(jié)果表明，接種哈茨木霉菌DQ002促進(jìn)了根腐病病原菌脅迫下黃瓜直根苗根系中PAL酶活性和類(lèi)黃酮總量的增加，可能通過(guò)激活苯丙氨酸代謝途徑中抗菌次生代謝物質(zhì)-類(lèi)黃酮的合成與積累，增強(qiáng)了細(xì)胞壁的抗菌侵染能力，進(jìn)而緩解了病原菌對(duì)根系細(xì)胞的攻擊與危害。辣椒接種根腐病病原菌后，嫁接辣椒根系中PAL 活性、可溶性糖、酚類(lèi)物質(zhì)和木質(zhì)素含量顯著增加，且嫁接辣椒根腐病發(fā)病率和病情指數(shù)顯著低于直根苗[41]。本研究中，嫁接苗能明顯降低黃瓜植株的根腐病發(fā)病率與病情指數(shù)，可能還與嫁接黃瓜苗根系中PAL活性、類(lèi)黃酮的合成有關(guān)，但是T2處理嫁接苗根系類(lèi)黃酮含量顯著低于T1處理以及木霉菌處理的黃瓜直根苗(T3和T4)，因此推測(cè)木霉菌和病原菌接種黃瓜直根苗可能存在雙重真菌的刺激作用，促進(jìn)類(lèi)黃酮積累，但木霉菌的促進(jìn)作用是否占重要地位，還不清楚，需進(jìn)一步進(jìn)行探索。這些結(jié)果也暗示了接種病原菌條件下，嫁接黃瓜苗苯丙氨酸代謝途徑生成的次生代謝物參與抗根腐病，但是其代謝物質(zhì)發(fā)揮抗菌作用不以類(lèi)黃酮為主要的抗病原菌物質(zhì)，可能還存在苯丙氨酸代謝途徑中合成的其他次生代謝物質(zhì)——酚類(lèi)物質(zhì)、木質(zhì)素等[41]，可能也是二者調(diào)節(jié)黃瓜根腐病發(fā)生率存在差異的原因之一，但需要從代謝組和分子生物學(xué)方面進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

當(dāng)植物受到病原菌侵染時(shí)，也會(huì)誘導(dǎo)植物體內(nèi)抗病相關(guān)的幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶類(lèi)活性升高，增加防御能力[56]。木霉菌幾丁質(zhì)酶基因(Chit42)在煙草、土豆以及大麥中的表達(dá)提高了其對(duì)土傳病害的抗性[57]，而哈茨木霉菌T-203接種黃瓜根系促進(jìn)了根系POD和幾丁質(zhì)酶活性升高，根系積累了大量的胼胝質(zhì)和纖維素，誘導(dǎo)了植株系統(tǒng)抗性增強(qiáng)[56]。這些研究說(shuō)明木霉菌接種植物根系后，能通過(guò)誘導(dǎo)抗病相關(guān)的幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶活性增強(qiáng)抗病能力。本研究中黃瓜直根苗在接種根腐病病原菌的條件下，接種木霉菌的處理(T3和T4)黃瓜直根苗根系幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶活性顯著升高，且明顯高于嫁接苗(T2)處理，這可能也是哈茨木霉菌DQ002降低黃瓜直根苗根腐病發(fā)生率能力高于嫁接苗的原因之一。高葦?shù)萚58]研究報(bào)道，在添加菌糠木霉菌發(fā)酵物后，土壤中幾丁質(zhì)酶和β-1, 3-葡聚糖酶的活性顯著升高，對(duì)病原真菌細(xì)胞壁具有較強(qiáng)的分解作用；在接種辣椒疫霉菌前，嫁接苗接穗的β-1,3-葡聚糖酶活性得到提高，且砧木抗病性越強(qiáng)，接穗中的抗病性相關(guān)酶活性越高[59]。前人的研究暗示了木霉菌的使用和嫁接栽培都能有效防治土傳病害，但本研究發(fā)現(xiàn)木霉菌接種處理對(duì)黃瓜直根苗的生理代謝及抗病相關(guān)酶活性的促進(jìn)作用強(qiáng)于黃瓜嫁接對(duì)黃瓜苗的調(diào)節(jié)作用，因此木霉菌處理的黃瓜直根苗發(fā)病率則低于嫁接苗的發(fā)病率，而二者對(duì)抗病相關(guān)酶的調(diào)節(jié)產(chǎn)生差異的分子生物學(xué)機(jī)理還不清楚。木霉菌接種植物根系刺激植物產(chǎn)生的H2O2、NO、乙烯等信號(hào)物質(zhì)參與了信號(hào)傳導(dǎo)及植物抗毒素物質(zhì)、類(lèi)黃酮、萜類(lèi)、酚類(lèi)物質(zhì)及其他殺菌物質(zhì)的合成[60]，且黃瓜與擬南芥中MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)參與了木霉菌激活植物抗毒素合成[56]，提高了抗逆能力。此外，哈茨木霉菌接種擬南芥促進(jìn)了WRKY18、WRKY40、WRKY60和WRKY33的表達(dá)，啟動(dòng)了JA介導(dǎo)的防御系統(tǒng)[61]，而在甜瓜中，哈茨木霉菌提高SA和JA水平，改變了甜瓜對(duì)尖孢鐮刀菌的響應(yīng)[62]；在煙草中，綠色木霉菌激活乙烯的釋放和植株抗逆系統(tǒng)[56]。而關(guān)于蔬菜嫁接栽培提高植株抗病害性能中，是否也存在與木霉菌調(diào)節(jié)植株抗病性能相同的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，鮮有報(bào)道；且在黃瓜抗根腐病方面，二者之間是否存在分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的差異而導(dǎo)致病害發(fā)生率差異，還需進(jìn)一步探討。

4 結(jié) 論