干旱脅迫下辣椒幼苗光合與熒光參數測定的最佳葉片

張澤宇,曹紅霞,裴書瑤,李曼寧

(西北農林科技大學水利與建筑工程學院旱區農業水土工程教育部重點實驗室，陜西 楊凌 712100)

光合作用是作物生長最基本的生理過程之一，作物有機物的積累都是通過直接或間接地改善作物的光合生理性能來實現[1]。植物葉片是植物進行光合作用的重要器官，葉片中的光合色素是葉片光合作用的物質基礎，葉綠素含量的高低在很大程度上反映了植株的生長狀況和葉片的光合能力，并與葉片光合強度密切相關[2]。為了維持葉綠素分子吸收光能的平衡，除了光合作用消耗的能量外，光合器官將其余光能以熒光和熱的形式散失。其中葉綠素熒光能快速靈敏地反映植物光系統的運轉狀況[3-4]。隨著植物光合作用研究的深入，越來越多的植物學科如農學、林學、植物生理學、植物生態學、園藝學和遺傳學的研究均涉及到葉片光合、熒光作用的測定[5]。目前用于測定光合、熒光參數的儀器一般是針對于植物葉片的，因此在對葉片的選擇上，應該盡量選擇有代表性的葉片，這對于光合、熒光參數測定代表性起著決定性的作用。在以往的研究中，學者們普遍選擇功能葉來測量葉綠素含量、氣體交換參數及葉綠素熒光等參數，以對植株的光合潛力進行評價。比如，通常選擇小麥完全展開的旗葉[6]、棉花的第三片或第四片葉[7]和完全展開的番茄幼葉[8]來量化光合作用。總的來說，所選擇的葉片都是充分展開并維持較高光合速率，能為植株提供有機養料的葉片[9-10]。但是這些研究并沒有考慮不同環境條件下功能葉片的變化。有研究得出，在脅迫條件下，如干旱脅迫，葉片會經歷一系列的變化。水分缺乏可能通過削弱抗氧化系統中CAT、POD和SOD的活性而加速葉片衰老。衰老葉片下調Rubisco活性/表達，導致葉綠素降解，影響光合作用[11]。此外，由于葉片在不同位置的生長發育階段不同，不同葉片對能量的需求也不同。根據植物生長發育規律，成熟早的葉后期光合能力會下降；而剛展開的葉，以輸入有機物為主，只有那些剛達到最大面積的葉才是光合產物的主要貢獻者。然而，這些葉片的光合作用對干旱脅迫的響應可能存在顯著差異[12]。因此，在干旱條件下哪個葉位最適宜進行光合、熒光參數測量還有待深入研究。

辣椒(Capsicumgenus)屬于茄科辣椒屬，是一年或多年生草本植物，因其營養豐富、味道鮮美而大量應用于食品、中藥行業，并在世界各地廣泛栽培[13]。從形態結構上來看，辣椒屬于淺根系植物，根細而弱，木栓化程度高，因此極易受干旱影響[14-15]。在以往的研究中，有學者選擇辣椒完全展開的第1片、第3片或第4片功能葉來測量光合、熒光參數[16-18]。但是在干旱脅迫下，哪個葉位對水分脅迫最敏感，最適宜測定光合、熒光參數還有待深入研究。

因此，本研究通過分析辣椒幼苗1～6葉位在不同干旱脅迫程度下葉綠素含量、氣體交換參數、葉綠素熒光參數及葉面積的變化，探索干旱條件下不同葉位的適應性機制，選擇出對水分脅迫最敏感的一個功能葉作為干旱條件下最適宜測定光合、熒光參數的典型葉片，以期為干旱條件下光合作用的快速評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗地概況

試驗于2020年5—7月在西北農林科技大學旱區農業水土工程教育部重點實驗室日光溫室內進行(34°17′N、108°01′E，海拔521 m)。該區屬暖溫帶季風半濕潤氣候，多年平均降水量632 mm，主要集中在6—10月，年均蒸發量1 500 mm。多年平均氣溫12.5℃，年均日照時數2 163.8 h,無霜期210 d。供試材料為辣椒，品種為“世紀紅”。試驗土壤為重壤土，取自西北農林科技大學附近0～20 cm 表土層，土壤容重1.4 g·cm-3，田間持水量33.6%(體積含水率)。

采用育苗移栽的方式種植，待4葉1心時定植(2020年5月29日),在定植前施基肥：每盆施0.071 g尿素(N：46.4%)、0.314 g磷酸二銨(P2O5：42%，N：15%)、0.404 g硫酸鉀(K2O：54%)。定植后澆一次緩苗水，隔兩周后(6葉期)開始水分脅迫處理，每天18∶00 采用稱重法補水，使土壤含水率維持在設定范圍內。試驗設有3個水分處理，即土壤相對含水率分別為土壤田間持水率的75%～85%(對照組CK)、65%～75%(輕度脅迫MS)和55%～65%(重度脅迫SS)。在土壤相對含水量達到各處理相應脅迫程度的第10、13、16天(8葉期)對辣椒幼苗從上到下完全展開的1～6葉位進行指標測定及取樣，每處理重復3次。采用盆栽方法，盆大小為:上口直徑×下底直徑×高為14.7 cm×9.1 cm×11.4 cm，每盆裝土1 kg。試驗過程中，每盆種植1株辣椒，每個處理10株，共種植30株。

1.2 測定指標與方法

(1)氣體交換參數。在各處理每一重復的3盆中隨機取1盆，共取3盆，從頂端向下選取完全展開的1～6片葉，采用Li-6800便攜式光合儀在晴天9∶00—11∶00測定凈光合速率(Pn)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導度(Gs)及蒸騰速率(Tr)。

(2)葉面積及葉綠素熒光參數。應用PlantScreen植物表型成像系統FluorCam 700 MF (Photon Systems Instruments, Czech Republic)對各葉位葉片的葉面積及熒光參數進行測量。暗處理30 min后放入表型成像系統中，測定暗適應后的最小熒光(F0)、葉片的PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)、光化學淬滅系數(qP)、非光化學淬滅系數(NPQ)等葉綠素熒光參數。

(3)葉綠素及類胡蘿卜素含量。應用80%丙酮提取各葉位葉綠素及類胡蘿卜素，再用分光光度計測量各色素的吸光度，通過Beer-Lambert公式計算其濃度：

Chla=12.21×A663-2.81×A646

Chlb=20.13×A646-5.03×A663

Car=(1000×A470-3.27×Chla-104×Chlb)/229

TChl=Chla+Chlb

再按以下公式計算各色素含量：

式中，C為葉綠體色素的濃度(mg·L-1)，FW為鮮重(g)，VT為提取液總體積(mL),n為稀釋倍數。

將水分脅迫后第10、13、16天3 d測量結果取平均值作為實際測量結果，采用Microsoft Excel 2019對試驗數據進行處理；使用SPSSv.21.0統計軟件進行雙因素方差分析，使用Tukey檢驗在P<0.05及P<0.01的顯著性水平上進行多重比較，并應用OriginPro 2021作圖。

2 結果與分析

2.1 水分脅迫對辣椒幼苗不同葉位氣體交換參數的影響

水分脅迫對辣椒幼苗不同葉位氣體交換參數的影響見圖1。由表1可知，水分處理(W)、葉位(L)及水分與葉位的交互作用(L×W)對Pn、Gs、Ci和Tr的影響均達到了極顯著水平(P<0.01)。由圖1A、1B、1D可知，在相同水分處理下，隨著葉位的增加(1～6葉位)，Pn、Gs和Tr先升高后降低。其中，充分供水時，Pn、Gs和Tr均在第3葉位達到最大值，分別為5.81、0.08、4.42 mmol·m-2·s-1，并與其他葉位呈顯著差異(P<0.05)；而在水分脅迫時(MS、SS)，Pn、Gs和Tr均在第4葉位達到最大值。對于同一葉位，隨著水分脅迫程度的增加，1～3葉位的Pn、Gs和Tr逐漸下降，4～6葉位的各參數值先升高后降低，在MS處理下取得最大值。

表1 水分處理、葉位及其交互作用對氣體交換參數影響的顯著性分析Table 1 Significance analysis of water treatment, leaf position and their interactions on gas exchange parameters

Ci的變化趨勢與Pn、Gs和Tr相反。由圖1C可知，在相同水分處理下，隨葉位的增加，Ci先降低后升高。其中，在充分供水時，第3葉位的Ci值最小，為235.94 μmol·mol-1，而在水分脅迫時(MS、SS)，第4葉位的Ci值最小，分別為242.58 μmol·mol-1和256.45 μmol·mol-1。對于同一葉位，隨著水分脅迫程度的增加，1～3葉位的Ci值逐漸增大，4～6葉位的Ci值先降低后升高，MS處理Ci值下降程度最大。

注：不同大寫字母表示水分處理間差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示葉位間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different capital letters indicated significant difference between water treatments (P<0.05); Different lowercase letters indicate significant difference between leaf positions (P<0.05). The same below.圖1 不同處理下辣椒幼苗不同葉位氣體交換參數Fig.1 Gas exchange parameters of pepper seedling at different leaf positions under different treatment

2.2 水分脅迫對辣椒幼苗不同葉位葉面積的影響

水分脅迫對辣椒幼苗不同葉位葉面積的影響見圖2。水分處理、葉位及水分與葉位的交互作用均對葉面積產生了極顯著的影響(P<0.01)。由圖2可知，不同葉位葉面積的變化趨勢和Pn相似，在相同水分處理下，隨著葉位的增加，葉面積先增大后減小；而同一葉位，隨著水分脅迫程度的增大，1～3葉位的葉面積逐漸減小，4～6葉位的葉面積先升高后降低。其中，在充分供水時，第3葉位的葉面積最大，為2 800.67 mm2，受干旱脅迫時(MS和SS),第4葉位的葉面積最大，分別達到了2 919.31 mm2和2 051.26 mm2。

圖2 不同處理下辣椒幼苗不同葉位葉面積Fig.2 Leaf area of pepper seedling at different leaf positions under different treatments

2.3 水分脅迫對辣椒幼苗不同葉位葉綠素熒光參數的影響

辣椒幼苗不同葉位葉綠素熒光參數受水分處理、葉位及水分與葉位的交互作用影響極顯著(P<0.01)(表2)。由圖3A、3D可知，同一水分處理下，隨葉位增加，F0與NPQ均為先降低后升高的趨勢，其中，在充分供水時，第3葉位的F0與NPQ值最小，分別為264.75和0.68；而在水分脅迫時(MS和SS)，第4葉位的F0與NPQ值最小。對于同一葉位，隨著水分脅迫程度的增加，F0逐漸增加，而NPQ在1～3葉位逐漸增加，4～6葉位卻先降低后增加，在MS處理時的值最小。

表2 水分處理、葉位及其交互作用對葉綠素熒光參數影響的顯著性分析Table 2 Significance analysis of water treatment, leaf position and their interactions onchlorophyll fluorescence

Fv/Fm、qP的變化趨勢與F0、NPQ相反。由圖3B、3C可知，在相同水分處理下，隨葉位增加，Fv/Fm與qP先增加后降低，在第3葉位達到最大值；對于同一葉位，隨水分脅迫程度的增加，1～3葉位的qP逐漸下降，4～6葉位的qP先升高后降低，其中，MS處理4～6葉位的qP較CK分別增加12.53%、11.27%及14.30%。干旱脅迫顯著降低了各葉位的Fv/Fm，且隨著脅迫程度的增加，Fv/Fm逐漸下降。在MS與SS處理，第4葉位的Fv/Fm值最大，分別為0.78和0.70。

圖3 不同處理下辣椒幼苗不同葉位葉綠素熒光參數Fig.3 Chlorophyll fluorescence of pepper seedling at different leaf positions under different treatments

2.4 水分脅迫對辣椒幼苗不同葉位光合色素的影響

由表3可知，在相同水分處理下，Chla、Chlb、Car及TChl含量隨葉位的增加先升高后降低，其中，在充分供水條件下，第3葉位的色素含量最多，在水分脅迫下(MS、SS)，第4葉位的色素含量最多。而對于同一葉位，隨著水分脅迫程度的增加，1～3葉位的色素含量逐漸降低，4～6葉位的色素含量先增加后降低，其中，MS處理4～6葉位的TChl含量較CK分別增加了14.44%、15.12%與20.83%。水分處理、葉位及水分與葉位的交互作用對各色素含量均產生極顯著影響(P<0.01)。

3 討 論

本研究表明在充分供水條件下，隨葉位的增加，Pn、Gs和Tr的變化趨勢與Ci相反，呈倒“V”形(圖1)。由于上部葉位葉片剛剛形成，幼葉生長旺盛，但許多內部結構還不完善，所以凈光合速率相對較低。但隨著葉片成熟，葉片結構逐漸完整，光合色素含量增加(表3)，各種調節機制逐步完善，凈光合速率相對較高，其中，第3葉位的凈光合速率最高。當葉片逐漸衰老，其組織結構開始遭到破壞，發生光合衰退、葉綠素逐步分解(表3)，細胞代謝水平下降，導致葉片光合能力也不斷下降[19]。在水分脅迫條件下，植物通過調整氣孔開閉程度來控制水分、氣體交換，氣孔開閉程度直接調節了氣孔導度。氣孔關閉在限制了水分向大氣散失的同時也限制了CO2進入氣孔腔[20-21]。在本研究中，水分虧缺使各葉位(除4～6葉位)Pn,Gs和Tr顯著降低(圖1A、1B、1D)，由于Pn下降，消耗的CO2減少，導致Ci增加(圖1C)。但在水分脅迫條件下(MS、SS)，第4葉位的Pn、Gs和Tr較其他葉位更高，說明此葉位應對干旱脅迫的能力更強。在充分供水條件下，隨葉位增加，葉面積先增大后減小，其中第3葉位的葉面積最大。而干旱脅迫降低了各葉位的葉面積(除MS處理4～6葉位葉面積增加外)，這可能是由于膨壓損失、光合作用和能量供應減少，細胞分裂和伸長受到干擾引起的[22-23]。但在水分脅迫條件下，第4葉位的葉面積最大，MS處理下的葉面積甚至比CK更大，可能是因為第4葉早于第3葉，受水分脅迫時第4葉基本達到最大面積，后期受影響小，而第3葉和2、1葉正在生長中，所以受影響較大。在本研究中，第3葉位光合參數及葉面積的變異系數均大于第4葉位，對水分脅迫更加敏感(表4)。光合色素能吸收光能，對植物來說至關重要，而色素濃度又易受葉齡及水分脅迫的影響[24-25]。在本研究中，充分供水條件下，葉綠素含量的變化趨勢與Pn相似，表明Chla、Chlb和TChl隨葉片成熟逐漸增加，在第3葉位達到最大值，這與Li等[26]的研究結果相似。而葉綠素含量與Pn在4～6葉位逐漸下降，可能是由于葉片衰老引起的(表3)。MS和SS處理各葉位的Chla, Chlb和TChl (除MS處理4～6葉位色素含量增加外)降低，這是氧化脅迫的典型特征，可能是由色素光氧化及葉綠素降解產生的。Car既是一種光合色素，也是一種內源性抗氧化劑，在光合作用和光保護中起著重要作用[27]。在本研究中，干旱脅迫降低了Car含量(除MS處理4～6葉位Car含量增加外)(表3)，植物猝滅活性氧的能力降低，細胞內積累了更多氧自由基，葉綠體的膜結構破壞，加速葉綠素的分解[28]。水分脅迫下第4葉位的各光合色素含量最多，對于其維持較高的光合能力具有重要作用。為了維持葉綠素分子吸收光能的平衡，光合器官應用了不同的策略，包括光吸收、光化學和光保護。其中最廣泛的光保護機制之一是以熱的形式在光系統II天線中耗散多余的光能，這參與了葉綠素熒光的非光化學猝滅(NPQ)[29]。有研究得出，NPQ的變化趨勢與Pn相反[30]。在本研究中，隨葉位增加，NPQ先降低后升高，且隨著水分脅迫程度的增加，各葉位的NPQ逐漸增加(除MS處理4～6葉位NPQ降低外)，其中，第4葉位的NPQ在MS處理時最低，說明此時該葉片將更多的能量應用于光化學反應(圖3D)。qP值近似于PSII反應中心開放的比例，代表光合作用消耗的能量[31]。在本研究中，qP和Pn的變化趨勢相似，干旱脅迫下，qP值降低(除MS處理4～6葉的qP增大外)，說明干旱脅迫降低了葉片的光轉換能力(圖3C)，其中CK第3葉位的qP最大，光轉換能力最強；水分脅迫時，第4葉位的qP最大，光轉換能力最強。F0為暗適應下最小熒光，代表了PSII反應中心的破壞程度[32-33]。本研究結果顯示，在充分供水條件下，隨著葉片的成熟(1～3葉位)Pn逐漸增加，F0逐漸減小；而隨著葉片衰老(4～6葉位)，Pn逐漸減小，F0逐漸增加。此外，F0隨干旱脅迫程度的增加顯著增加(圖3A)，這可能是由于光系統II (D1蛋白和PS的其他部分)的降解或能量向反應中心轉移中斷引起的[4]。在水分脅迫時，第4葉位的F0最小，PSII反應中心的破壞程度最小。Fv/Fm可以用來反映PSII的最大效率(所有PSII中心開放時的效率)[34]。在充分供水條件下，1～3葉位的Fv/Fm逐漸增加說明植物的光能利用效率逐漸增強(圖3B)。而隨著葉片衰老及干旱脅迫程度的增加，Fv/Fm顯著下降，這可能是由于PSII反應中心同化能力下調及葉綠素含量降低導致的[35-36]。充分供水時，第3葉位的Fv/Fm最大，水分脅迫時，第4葉位的Fv/Fm最大，但第3葉位對水分脅迫更加敏感，其變異系數較第4葉位更大(表4)。

表3 不同處理下辣椒幼苗不同葉位光合色素含量Table 3 Photosynthetic pigments content of pepper seedling at different leaf positions under different treatments

表4 水分脅迫下辣椒幼苗第3、4葉位各參數的變異系數Table 4 Variation coefficient of parameters at 3rd and 4th leaf positions of pepper seedling under water stress

4 結 論

在充分供水時，隨葉位的增加，Pn、Gs、Tr、葉面積、光合色素含量、qP、Fv/Fm均呈先增加后降低的趨勢。其中，第3葉位的光合色素含量最多，Pn、qP、Fv/Fm最大，NPQ、F0最小，說明與其他葉位相比，充分供水時第3葉位的光轉換能力及光能利用效率更強。而在干旱脅迫時，隨著脅迫程度的增大，各參數逐漸降低(除Ci、F0、NPQ外)，其中，第4葉位的光合色素含量最多，這對于其維持較高的光合能力具有重要作用。與其他葉位相比，第4葉位的qP、Fv/Fm最大，NPQ、F0最小，說明與其他葉位相比，受干旱脅迫時第4葉位的PSII反應中心的破壞程度更小，光轉換能力及光能利用效率更強，并將更多的能量應用于光化學反應。第3、4葉位是對辣椒幼苗生長具有主要貢獻的葉片，但在水分脅迫條件下，第3葉位光合參數、葉面積、葉綠素含量及葉綠素熒光參數的變異系數較第4葉位更大，說明第3葉位對于水分脅迫更加敏感。因此，在干旱脅迫試驗中，宜選用第3葉位測量辣椒幼苗光合、熒光參數。