鹽脅迫下配施鈣肥對花生根際土壤細菌群落結構的影響

戴良香，丁 紅，徐 揚，張冠初，史曉龍， 秦斐斐，郭 慶，姜常松，張智猛

(1.山東省花生研究所，山東 青島 266100；2.沈陽農業大學農學院，遼寧 沈陽 110866；3. 海陽市果業發展服務中心，山東 煙臺 265100)

土地鹽堿化是世界范圍內面臨的重要環境問題，近50%的灌溉土地有不同程度的次生鹽堿化[1]。中國是世界上土地鹽堿化面積最大的國家之一，可利用的鹽堿地面積達670萬公頃，其中中輕度鹽堿地面積占30.1%，中重度鹽漬化威脅的低產田占總耕地的22%，此區溫光熱等自然資源較為充沛，農業開發利用潛力巨大[2-3]?；ㄉ侵匾挠土虾徒洕魑?，抗逆性較強，并具耐瘠、固氮、培肥地力等特性，還可耐受0.30%～0.45%的鹽濃度，種植效益明顯，抗風險能力較強，是鹽堿土區重要經濟和油料作物的適宜替代作物[4]，在緩解糧油作物爭地矛盾、保障我國食用油安全領域具有明顯的產業優勢。

植物根際微生境是土壤中活性最強的微生境，也是植物獲取養分的主要區域。在此微域里植物—微生物—土壤—環境間相互作用，共同維持著根際微生態系統的平衡，影響作物生產[5]。研究表明，鹽脅迫使土壤微生物群落結構和組成發生變化，植物根際微生態區系失衡，并與環境和植物種類有關[6-7]。濱海鹽堿土較高含鹽量的根層土壤微生物種類、優勢種群數量和群落功能多樣性較非鹽堿土壤更為豐富[8]。外源施鈣對鹽堿土具有較強的降鹽改土效果[9-11]，對花生光合產物積累及產量品質提高具有促進作用[12-13]，但有關外源鈣對鹽脅迫下花生不同生育時期根際微生物群落特征變化的影響鮮見報道。本試驗以鹽脅迫下旺盛生長期和成熟期花生根際土壤為研究對象，利用高通量測序技術對土壤中細菌種類及多樣性進行系統分析，探討鹽脅迫下配施鈣肥對不同生育時期花生根際土壤細菌群落組成和多樣性的影響，有助于認識鹽堿地花生根際土壤微生物群落功能調節并發掘新的功能類群，對改良鹽堿土壤和開發利用鹽堿土區資源、提高鹽堿土區農業種植結構抗風險能力及鹽堿地花生高產優質栽培均具重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇花生品種花育25號(HY25)為試驗材料。供試土壤采用山東省花生研究所萊西試驗站耕地0～20 cm表層土壤，其基本理化性質：土壤有機質含量12.84 g·kg-1，全氮1.82 g·kg-1，全磷(P2O5)1.02 g·kg-1，全鉀(K2O)11.01 g·kg-1，水解氮(N)102.5 mg·kg-1，速效磷(P2O5)13.1 mg·kg-1，速效鉀(K2O)114.2 mg·kg-1，土壤pH值6.9，土壤含水量9.34%。

1.2 試驗設計

試驗于山東省花生研究所試驗站防雨棚中進行，土壤風干、過篩(1 cm)后裝入同批次、同規格塑料盆中(底部直徑為36 cm，高為26 cm)，每盆裝土量為18 kg。選取飽滿均勻的種子，每盆播6粒，播深均為3 cm，留4株長勢一致的幼苗。

設置3個鹽脅迫梯度：0.00 g·kg-1(Y0)、1.5 g·kg-1(Y1)、3.0 g·kg-1(Y2)，用分析純NaCl重量法調節鹽分濃度，以烘干土為基數。各處理均配合施用鈣肥(CaO)150 kg·hm-2(C)。播種前先將供試三元復合肥(15∶15∶15)按300 kg·hm-2的用量與鈣肥以基肥形式均勻施入各栽培盆中，隨后各處理澆入2 L清水沉實，待土壤墑情適宜時將土壤充分混勻，以使鹽分與施入的基肥和鈣肥均勻分布。以原狀土(不施鈣肥、三元復合肥和NaCl)為對照，隨機排列，6次重復。分別于開花下針期(播后75 d)和收獲期(播后125 d)采集花生植株根際土壤樣本。根際土壤樣本的采集以處理為單元進行，采用多點混合樣本采集方法，以盆為單位分別小心地從盆中取出植株，去除根際附著不緊密的土壤，然后用無菌刷收集附著緊密的土壤，混合每盆中植株根際土壤，每3重復根際土壤樣品混合為1個生物學樣本重復，每處理均獲取2個生物學重復，封入無菌袋，置于冰盒帶回實驗室，保存于-80℃冰箱備用。

開花下針期各處理土壤樣本分別表示為CK、CY0、CY1、CY2，收獲期各處理土壤樣本分別表示為HCK、HCY0、HCY1、HCY2。相關測試由北京諾賽基因公司進行。

1.3 土壤DNA提取

收集所得土壤樣品利用OMEGA土壤總DNA提取試劑盒(OMEGA soil DNA kit)進行提取。所得DNA采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop2000 分光光度計檢測DNA的純度和濃度。

1.4 16s rRNA文庫構建及高通量測序

以提取的土壤樣本DNA為模板，利用引物340F：CCTACGGGNBGCASCAG以及805R：GACTACNVGGGTATCTAATCC對16s rRNA基因的V3-V4區進行擴增。擴增程序：95℃預變性3 min；30個循環(95℃，30 sec；50℃，30 sec；72℃，60 sec)；72℃，7 min。PCR 產物使用1.5%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據PCR 產物濃度進行等濃度混樣，充分混勻后使用0.5×TBE 濃度1.5%的瓊脂糖凝膠電泳純化PCR 產物，割膠回收目標條帶。產物純化試劑盒使用的是QIAGEN公司的MinElute膠回收試劑盒。最后使用HiSeq2500進行250PE測序。

1.5 土壤微生物的生物信息學分析

對花生根際土壤微生物的多樣性和豐富度進行Alpha多樣性和樣本間Beta多樣性分析，同時進行群落結構統計分析和基于OTU的物種組成聚類，分析挖掘樣本間物種組成差異和生物功能分析。

2 結果與分析

2.1 花生根際土壤微生物群落測序數據分析

OTU為基于序列相似性閾值的樣本序列，一般將相似性值≥97%的序列定義為同一個OTU。圖1A顯示，多數樣本序列平均長度在400～502 bp，部分樣本序列長度在450～500 bp之間。通過維恩圖分析，各處理根際土壤樣本共有OTU數量 2 446個，存在于CY1、CK、CY2處理樣本中的OTU數分別為29、25個和23個，而存在于HCK、HCY0和HCY2各處理樣本中的OTU數均不足10個，表明各處理樣本微生物組成非常相似，開花下針期根際微生物物種較為豐富(圖1B)。

圖1 花生根際土壤細菌群落測序數據分析Fig.1 Overall sequence data of bacterial communities in the peanut rhizosphere

2.2 多樣性分析

2.2.1 稀釋曲線 稀釋性曲線(Rarefaction curves)可顯示花生根際細菌基因測序深度和群落多樣性，被用來評價測序量是否足以覆蓋所有類群。如圖2所示，隨測序數據量的增加物種豐富度呈現前期迅速增加的趨勢，各處理樣本在測序量達到30 000條以上時，稀釋曲線趨近平緩，各處理土壤樣本微生物群落測序數據達到飽和，測序量能夠覆蓋花生根際土壤微生物組群落的絕大部分物種(圖2A)。各處理樣本重復間取其均值進行比較發現，對照、鹽脅迫和配施鈣肥各處理OTU數量基本一致，相互間均無顯著差異。

Rank Abundance曲線能直觀地顯現各樣本中OTU的均勻度和豐富度。當各樣本OTU數量小于1 000時，曲線下降迅速、不平緩，相對應的物種相對豐度較高但均勻度較低，當OTU數量大于2 000時曲線較為平緩，相對應的物種相對豐度較低，在土壤樣本分布較為均勻(圖2B)。各處理樣本間曲線寬度及平滑程度較為一致，表明不同處理樣本中物種豐富度及均勻度均無顯著差異。

圖2 稀釋性曲線和Rank Abundance曲線分析Fig.2 Rarefaction curves and Rank Abundance curves analysis

2.2.2 多樣性指數 通過多樣性指數組間差異分析發現，各處理樣本微生物群落中OTU的Chao和Sob指數分別為3522.40～3762.58和3113.00～3428.50。Shannon和Simpson多樣性指數為6.57～7.11和0.001946～0.005682，Shannon多樣性指數除HCY0與HCY1間、HCY1與HCY2間無顯著差異外，其余處理間均呈顯著或極顯著差異；開花下針期各處理樣本OTU的Shannon多樣性指數均顯著或極顯著高于收獲期，而Simpson多樣性指數則是收獲期顯著或極顯著高于開花下針期(圖3A,3B,3C,3D)。鹽脅迫可提高花生根際微生物群落豐富度和多樣性，并與生育時期有關。

圖3 多樣性指數組間差異分析Fig.3 Difference analysis of diversity index between groups

2.3 花生根際土壤細菌物種群落組成分析

2.3.1 全樣本綱水平菌落結構分析 各處理樣本群落物種組成共有73個綱， Top11(其余合并<0.03)菌綱相對豐度之和為85.09%，其中Actinobacteria放線菌綱、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)和γ-變形桿菌綱(Gammaproteobacteria)3個菌綱相對豐度均在12.64%以上，三者之和為45.88%。疣微菌綱(Verrucomicrobiae)、Saccharimonadia、芽單胞菌綱(Gemmatimonadetes)、擬桿菌綱(Bacteroidia)和酸桿菌綱(Acidobacteriia)的相對豐度均在5.01%以上?；┾}肥處理可使放線菌綱(Actinobacteria)、Saccharimonadia菌綱豐度明顯降低，并隨鹽脅迫強度提高豐度降幅明顯，且以開花下針期降幅較大，其CY2、HCY2分別較其對照降低-43.36%、-27.59%和-92.456%、-78.31%。施鈣肥使γ-變形桿菌綱和疣微菌綱豐度提高，并有隨鹽脅迫強度升高呈升高趨勢，其CY2、HCY2分別是其對照的1.2、1.8倍和1.6、1.5倍，尤以收獲期升高明顯(圖4)。表明鹽脅迫及其強度和基施鈣肥處理能顯著提高γ-變形桿菌綱和疣微菌綱豐度，并隨生育時期的延長更為明顯。

圖4 花生根際土壤細菌菌落綱水平結構Fig.4 Bacterial community structure in peanut rhizosphere at class levels

2.3.2 全樣本科水平菌落結構分析 圖5示出，所有樣品包含的351個科中其Top12(其余合并<0.03)菌科相對豐度之和為42.77%，其中，相對豐度在3.24%以上的優勢菌科有norank_o__Saccharimonadales、鞘脂單胞菌科、芽單胞菌科、伯克氏菌科和norank_o__Gaiellales菌科等5個，其相對豐度分別為7.59%、6.41%、5.08%、4.14%和3.24%。norank_o__Saccharimonadales、norank_o__Gaiellales、噬幾丁質菌科(Chitinophagaceae)和豐佑菌科(Opitutaceae)豐度受鹽脅迫強度和花生生育進程影響較大，并隨鹽脅迫強度的升高增降幅度顯著，其中，norank_o__Saccharimonadales和norank_o__Gaiellales兩菌科豐度于開花下針期和收獲期分別較對照增加-72.27%、-67.08%和-81.20%、-51.75%，噬幾丁質菌科和豐佑菌科(Opitutaceae)豐度則分別增加56.58%、120.98%和86.15%、137.41%。收獲期norank_o__Saccharimonadales和鞘脂單胞菌科各處理的平均相對豐度是開花下針期的2.1倍和1.87倍，其中，HCK、HCY0分別是CK、CY0的1.92倍和2.68倍。

圖5 花生根際土壤細菌菌落科水平結構Fig.5 Bacterial community structure in peanut rhizosphere at family levels

2.3.3 全樣本種水平菌落結構分析 圖6示出，各處理花生根際土壤樣品包含1 279個菌種，Top13(其余合并<0.02)菌種相對豐度總和為22.56%。兩生育時期unclassified_g_norank_f_norank_o_Saccharimonadales、uncultured_bacterium_g_norank_f_norank_o_Saccharimonadales和unclassified_f_Micrococcaceae豐度均隨鹽脅迫強度的升高明顯降低且收獲期均顯著高于開花下針期。但開花下針期unclassified_k_norank_d_Bacteria豐度則顯著高于收獲期。其中，HCK和HCY0分別是CK和CY0的3.7、2.0倍?；ㄉ龝r期和鹽脅迫顯著影響根際細菌菌種水平組成的相對豐度。

圖6 花生根際土壤細菌菌落種水平結構Fig.6 Bacterial community structure in peanut rhizosphere at species levels

2.4 花生根際土壤細菌多樣性分析

利用Qiime軟件對各處理樣本細菌群落進行PCoA分析(OTU水平)，觀察個體或群體間的差異。

兩軸對排序結果的解釋率分別為41.35 %和18.88 %，HCK、HCY0、HCY1和HCY2收獲期各樣本聚集于圖左側，開花下針期樣品聚集于圖右側，HCK、HCY0、CK和CY0處理的樣本分布于圖中下部，鹽脅迫及施用鈣肥處理的樣本則分布于圖上部(圖7A)。花生根際微生物菌群類型鹽脅迫影響強烈，非鹽堿土壤及其基施鈣肥處理微生物菌群類型受影響較小，生育時期不同根際微生物菌群分異明顯。

注：*代表P<0.05。 Note: * indicates P<0.05.圖7 基于weighted unifrac 距離的土壤微生物群落多樣性分析(PCoA)Fig.7 Principal coordinate analysis (PCoA) of soil microbial communities based on weighted unifrac distance

對距離矩陣進行OTU水平層級聚類(Hierarchical clustering)，可以看出，在0.15～0.22相似性水平上，16個樣本細菌組成可以分為4大組，CK和CY0、CY1和CY2分別聚為一組，HCY0、HCK和HCY1聚為一組，HCY2為一組。之后，又以生育時期為單位(開花下針期和收獲期)各聚為一組后，所有樣品聚為一族。CK、 CY0和CY1處理在聚類圖與其他樣品距離最遠，與其他樣品細菌群落差異最大(圖7B)?；ㄉ⑸L期無鹽和低鹽處理根際微生物細菌群落與高鹽脅迫和成熟期根際樣品間差異明顯。

運用Kruskal-Wallis秩和檢驗(Kruskal-Wallis H test)，對各處理樣本進行優勢菌門(圖7C)和優勢菌科(圖7D)的組間差異顯著性檢驗分析，結果表明，在門水平，變形菌門、Patescibacteria和疣微菌門在各處理間存在顯著差異。在科水平，norank_o_Saccharimonadales、Micrococcaceae和Pedosphaeraceae各處理間差異顯著(*,P<0.05;**,P<0.01)。

2.5 16S功能預測分析

16S功能預測是通過PICRUSt10(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)對OTU豐度表進行標準化，去除16S marker gene在物種基因組中拷貝數目的影響，通過每個OTU對應的greengene id，獲得OTU對應的COG家族信息以及功能信息，從而得到花生根際微生物群落的功能豐度譜。圖8示出，與物種組成相比，所有樣本的COG功能組成較為相似。各處理樣本富集功能(COG功能)均主要包括氨基酸轉運與代謝、能量生產和轉換、信號轉導機制、轉錄、細胞壁/膜/包膜生物發生、碳水化合物的運輸和代謝、無機離子的運輸和代謝、復制重組和修復、翻譯/核糖體結構和生物發生等，表明各處理根際樣本中微生物代謝功能非常豐富(圖8A)。

通過KEGG代謝途徑的預測差異分析發現，CK、HCK、HCY2處理樣品中微生物群落的功能豐度均明顯降低，尤以其他次生代謝產物的生物合成、聚糖的生物合成與代謝、萜類和聚酮化合物的代謝、細胞運動和抗菌耐藥性顯著降低；CY0、CY1、CY2、HCY0和HCY1處理豐度均明顯提高，尤以氨基酸代謝、能量代謝、輔助因子和維生素的代謝和核苷酸代謝各功能富集明顯。施用鈣肥明顯提高根際土壤細菌能量代謝、氨基酸和核苷酸等物質代謝功能，抗逆性和聚糖、萜類和聚酮化合物等其他次生代謝產物的生物合成物種豐度明顯降低(圖8B)。無鹽脅迫處理樣品的微生物群落功能豐度和高濃度鹽脅迫下收獲期樣品的微生物群落功能豐度均明顯降低，適度鹽脅迫使得根際土壤微生物群落功能豐度升高，其物質、能量代謝功能增強，以抵抗鹽脅迫逆境的抑制和危害。

圖8 土壤細菌菌群功能預測Fig.8 Bacterial functional features on cluster of orthologous groups (COG) analysis

2.6 鹽脅迫下配施鈣肥對花生產量的影響

由表1看出，鹽脅迫明顯影響花生出米率、百果質量、百仁質量和莢果產量，并隨鹽脅迫程度的提高作用顯著，施用鈣肥可顯著提高無鹽脅迫處理下的百果質量和莢果產量，對出米率和百仁質量有促進作用但不顯著，鹽脅迫處理的百仁質量較CK和CY0分別降低12.94%、20.44%和38.70%、43.98%，高鹽脅迫處理的莢果產量僅分別為CK和CY0的50.0%和40.4%。可見，鹽脅迫嚴重抑制花生籽仁發育和產量形成，施用鈣肥可提高花生產量，鈣肥對鹽脅迫下的作用機理有待深入研究。

表1 鹽脅迫下施鈣肥對花生產量及產量構成因素的影響Table 1 Effects of calcium fertilizer application on peanut yield and its components under salt stress

3 討 論

植物根際環境與土壤中的微生物菌群關系密切,其根際微生物群落動態極可能直接影響著植物健康及養分高效利用。在植物生長過程中，環境微生物受根際分泌物的刺激和鹽濃度影響，存在著微生物適應性和群落分布的演變，受植物種類、生長階段、水肥吸收規律、健康狀況及土壤理化性質等的影響[14-16]。土壤鹽漬化所引發的生態災難是由鹽脅迫對地上部植物群落與土壤微生物群落同時作用后產生的結果[17-19]。土壤鹽脅迫程度影響根際微生物類型和群落組成，在無鹽或低鹽條件下土壤微生物數量、豐富度、活性與鹽分含量呈負相關，鹽堿脅迫處理顯著降低根際土壤細菌群落豐富度和群落功能穩定性[20-23]。鹽脅迫條件下耐鹽植物根際環境中細菌群落組成與其耐鹽性有關，中度耐鹽植物根際環境中變形菌門和厚壁菌門較豐富，輕度耐鹽植物根際環境中含有較多的酸桿菌門和芽單胞菌門細菌[7，24]。黃河三角洲濱海鹽堿土高含鹽量土壤根際微生物種類、優勢種群數量和群落功能多樣性較非鹽堿土更為豐富。濱海鹽堿地花生根際土壤優勢細菌門為變形菌綱(α-變形菌綱、γ-變形菌綱、β-變形菌綱和δ-變形菌綱)、放線菌門、酸微菌綱、厭氧繩菌綱、嗜熱油菌綱、纖維粘網菌綱和芽孢桿菌綱等。鹽堿土壤花生根際γ-變形菌綱和酸微菌綱/目(Acidimicrobiia)豐度是非鹽堿土壤花生根際的3～5倍，而嗜熱油菌綱和Gaiellales菌目的豐度則正好相反，其僅是非鹽堿土壤花生根際的1/5～1/3[25-27]，本試驗結果與前人研究結果基本一致。鹽脅迫和較高的強度顯著影響根際微域群落結構，對花生根際細菌菌群組成結構具有顯著調控效應，其豐富度和多樣性提高，在花生旺盛生長期作用更為明顯。但鹽脅迫下外源施鈣對根際微生物菌群結構的影響較小。各處理根際樣本其優勢菌綱均為放線菌綱、α-變形菌綱、γ-變形桿菌綱、疣微菌綱、Saccharimonadia、芽單胞菌綱、擬桿菌綱和酸桿菌綱等。優勢菌科有norank_o__Saccharimonadales、鞘脂單胞菌科、芽單胞菌科、伯克氏菌科和norank_o__Gaiellales菌科。

鹽脅迫和基施鈣肥處理均能顯著提高γ-變形桿菌綱和疣微菌綱豐度，并隨生育期的推進和鹽脅迫強度提高更為明顯。但鹽脅迫下基施鈣肥處理可使放線菌綱、Saccharimonadia菌綱豐度明顯降低，并隨鹽脅迫強度提高豐度降幅明顯，且開花下針期降幅較大。噬幾丁質菌科和豐佑菌科的豐度受鹽脅迫強度和生長階段影響顯著，并隨鹽脅迫強度升高而顯著提高。各處理變形菌門、Patescibacteria和疣微菌門間以及norank_o__Saccharimonadales、Micrococcaceae和Pedosphaeraceae菌科間差異均達顯著水平。

根際微生物群落在植物和土壤之間發揮著重要作用，植物在不同生長階段對其根際微生物種類及豐度產生顯著影響[28-29]。不同的發育階段其根際微生物種類和數量存在較大差異，黃瓜、大豆、玉米等作物主要根際微生物數量隨生長發育呈動態變化，從生長初期到盛果期持續增加，生長后期有所下降[30-32]。蒙古黃芪不同生育期內根際土壤細菌變化最為明顯，不同種源間根際微生物群落組成相似[33-34]。本試驗結果表明，花生生長發育時期對根際菌群結構影響顯著，不同生育時期根際微生物菌群類型分異明顯，旺盛生長期低鹽處理根際微生物細菌群落與高鹽脅迫和成熟期根際樣品間差異明顯。生長盛期和基施鈣肥處理的氨基酸代謝、能量代謝、輔助因子和維生素的代謝和核苷酸代謝等功能基因豐度顯著提高。因此，從植物根際分離篩選具有多種植物促生耐鹽特性的優勢菌株，開發具有增強主要糧食作物耐鹽脅迫能力的根際促生菌，研制鹽堿地糧食增產的專用微生物肥料，為鹽堿地高效利用和農業增產提供技術保障，是今后高效開發利用鹽堿地潛力的重要方向。

4 結論

花生根際土壤微生物優勢菌群組成結構不受鹽脅迫和生育時期的影響，各處理根際樣本微生物組成相似，并以開花下針期根際微生物物種較為豐富，但根際細菌群落相對豐度受鹽脅迫及其強度影響。各處理優勢菌綱均為放線菌綱、α-變形菌綱、γ-變形桿菌綱、疣微菌綱、芽單胞菌綱、擬桿菌綱和酸桿菌綱，鹽脅迫和基施鈣肥可顯著提高γ-變形桿菌綱和疣微菌綱豐度，并隨生育時期的延長更為明顯。施用鈣肥使得變形菌門、Patescibacteria和疣微菌門在門水平下各處理間顯著差異；花生生長時期、鹽脅迫強度使根際微生物細菌群落間差異明顯。較高濃度鹽脅迫下花生收獲期樣品的微生物群落功能豐度明顯降低，但較低強度鹽脅迫使其豐度升高，其物質、能量代謝功能增強，以抵抗鹽脅迫逆境的抑制和危害。