北京市結防機構2019年非結核分枝桿菌臨床分離株危險因素及耐藥情況分析

楊新宇 趙琰楓 易俊莉 陳昊 陳雙雙 代小偉 丁北川 孫閃華 李傳友

非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria, NTM)是指除結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌以外的分枝桿菌。由非結核分枝桿菌引起的疾病稱為非結核分枝桿菌病。目前，已報道的分枝桿菌菌種數量超過190種，但其中只有少部分為條件致病菌[1-2]。

近年來，隨著結核病的控制取得長足進步，非結核分枝桿菌的問題越來越突出，非結核分枝桿菌病呈現快速增長的趨勢，我國結核病流行病學調查結果顯示，2010年NTM分離率為22.9%[3]，遠遠高于1990年(4.9%)和2000年(11.1%)。NTM主要引起肺部和皮膚的病變，臨床表現與結核引起的感染十分相似，如果沒有及時進行菌型鑒定，極容易與結核感染相混淆，被誤認為為耐藥結核而延誤病情。為了解北京市NTM流行情況，筆者收集2019年北京市各級結防系統NTM臨床分離株進行菌種及藥敏鑒定，為科學制定北京市NTM診療策略提供依據。

資料與方法

一、 研究對象和實驗材料

1 研究對象 本研究使用的臨床分離株均由北京市疾病預防控制中心提供，標本來源于2019年1月1日至12月31日期間北京市14家結防機構(北京結核病控制研究所、昌平區結核病防治所、朝陽區疾病預防控制中心結防所、大興區結核病預防控制中心、東城區疾病預防控制中心結核病防制科、房山區疾病預防控制中心結防所、懷柔區疾病預防控制中心結防科、密云區結核病防治所、平谷區結核病預防控制中心、石景山區疾病預防控制中心結防所、順義區結核病防治中心、通州區疾病預防控制中心結防所、西城區疾病預防控制中心結防所、延慶區疾病預防控制中心結防所)和6家定點醫院[豐臺區中西醫結合醫院、豐臺區鐵營醫院、中國航天科工集團731醫院(豐臺區)、航天總醫院(豐臺區)、北京老年醫院(海淀區)、北京京煤集團總醫院(門頭溝區)]分離出的NTM菌株，數據涵蓋北京地區的全部結防機構(豐臺區、海淀區、門頭溝區結核病的臨床診療工作由各區定點醫院承擔)。

本項目研究資料源于本市16個區縣及市結防系統所有分枝桿菌培養陽性臨床分離菌株，所有區縣及市結防機構陽性菌株均交由北京結核病控制研究所中心實驗室保存，研究已通過北京結核病控制研究所倫理委員會的審批(倫理批號：202005)。

2 儀器與試劑

(1)分枝桿菌中性羅氏培養基、初步菌種鑒定培養基[對硝基苯甲酸(PNB)500μg/mL]以及比例法所需藥敏培養基(異煙肼(INH)0.2 μg/mL，利福平(RFP)40 μg/mL,鏈霉素(Sm)4 μg/mL，乙胺丁醇(EMB)2 μg/mL，左氧氟沙星(Lfx)2 μg/mL，阿米卡星(Am)30 μg/mL，卷曲霉素(Cm)40 μg/mL，丙硫異煙胺(Pto)40 μg/mL，對氨基水楊酸(PAS)1 μg/mL)均由河南賽諾特生物技術有限公司提供。

(2)分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(PCR-熒光探針法)、雜交儀、芯片洗片機、掃描儀均由成都博奧晶典生物科技有限公司提供，擴增所需PCR儀由杭州博日科技有限公司提供。

(3)分枝桿菌菌種鑒定基因測序送至北京六合華大基因科技有限公司。

二、實驗方法

1 分枝桿菌菌種鑒定及初步菌群鑒定 實驗方法采用實驗室非結核分枝桿菌篩查推薦流程[4]，采用表型法進行初步菌群鑒定，確定為非結核分枝桿菌者采用分子生物學中基因芯片的方法進行菌種鑒定，初步菌群鑒定與基因芯片方法不一致的菌株，采用測序的方法進行最終鑒定。每名患者只檢測一次，同一年份多次凍存的患者菌株按第一次統計。

(1)菌群檢測(表型法)：所有菌株鑒定均按照《結核病實驗室檢驗規程》[5]，使用含PNB羅氏培養管鑒定區分該菌株屬于結核分枝桿菌群(MBC)和非結核分枝桿菌群(NTM)。取初生長4周的分枝桿菌菌株，使用生理鹽水制備成麥氏標準濁度為1mg/mL的菌懸液,經稀釋后將終濃度為10-1mg/mL的菌懸液0.1mL接種到含PNB羅氏培養管及對照管(普通羅氏培養基)中，37℃恒溫培養4周，如對照管中分枝桿菌生長良好，則報告菌群初步鑒定實驗結果；如果在對照管中沒有生長，則需重新進行實驗。PNB陰性定為MBC；PNB陽性定為NTM。

(2)菌種檢測(分子生物學法):① 微陣列基因芯片：將PCR產物置于PCR儀中95℃變性5 min，隨后立即置于冰水混合物中驟冷冰浴3 min；按鑒定試劑盒操作說明書吸取14微升，雜交混合物經加樣孔加入芯片點陣中，50℃ 5rpm雜交2h，用SDS、SSC洗液沖洗干凈，甩干后放入芯片掃描儀用專用軟件判讀芯片結果。②基因測序：兩種方法檢測結果不同的菌株，經傳代分離純化后提取核酸送至北京六合華大基因科技有限公司，對16SrRNA基因測序，測序結果進行 NCBI-BLAST 比對，NCBI 鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

2 藥物敏感性檢測 按照《結核病實驗室檢驗規程》[5]采用1%比例法對培養陽性的NTM臨床分離株進行抗結核藥物的藥敏試驗。藥物包括四種一線抗結核藥物和四種二線抗結核藥物：異煙肼(INH)、利福平(RFP)、鏈霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)、左氧氟沙星(LFX)、阿米卡星(AK)、卷曲霉素(CPM)、對氨基水楊酸(PAS)；若耐藥比例≥1%，則判斷為受試菌對該抗結核藥耐藥(耐藥百分比=含藥培養基上生長的菌落數/對照培養基上生長的菌落數×100%)。

3 質量控制

(1)菌種鑒定質量控制：①每批菌種鑒定均采用試劑盒自帶陽性對照及陰性對照質控品檢測微陣列基因芯片菌種鑒定結果。②菌群鑒定每年參加國家疾病預防控制中心結核病參比實驗室的室間質評，考核成績均為優秀。

(2)藥敏試驗質量控制：①每批試驗以結核分枝桿菌標準株H37Rv 10-3mg檢測含藥培養基質量。②若高稀釋度菌液(10-4mg/mL)在對照培養基上生長的菌落數少于20個，則重復試驗。③比例法藥敏試驗每年參加國家疾病預防控制中心結核病參比實驗室的室間質評，考核成績均為優秀。

三、數據統計分析方法

應用SPSS19.0軟件對數據進行整理和統計分析，對NTM組與結核分枝桿菌(TB)組的暴露因素進行單因素分析，計數資料采用卡方檢驗，計量資料采用t檢驗，并將單因素分析中所有影響因素納入多因素logistic回歸分析模型進行分析，計算對應的OR值(95%CI)。P<0.05時判斷為差異有統計學意義。

結 果

一、非結核分枝桿菌分離率及菌種分布

2019年分枝桿菌培養陽性菌株1254株，通過PNB鑒別培養基生長實驗檢出NTM85株，經微陣列基因芯片檢測技術進行菌種檢測共鑒定出非結核分枝桿菌81株(其中1株為“無法判讀”)，4株為結核分枝桿菌;“無法判讀”菌株經基因測序檢測技術鑒定為慢黃分枝桿菌，4株不一致菌株經基因測序檢測技術鑒定2株為結核分枝桿菌，1株為測序雜合，1株為鹽單胞菌，共檢出NTM81株，NTM分離率為6.5%(81/1254，95%CI：0.051～0.078)，緩慢生長型占59.26%，快速生長型占40.74%。檢出率前四位的NTM分別為：胞內分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶然分枝桿菌。81株NTM分布情況如下(見表1)。

表1 2019年非結核分枝桿菌菌種分布

二、2019年非結核分枝桿菌流行病學資料及危險因素分析

以分離出非結核分枝桿菌的菌株為因變量，單因素回歸分析中(見表2)，與分離出TB組相比，差異有統計學意義的指標：治療史(初治=0，復治=1)、年齡(計量資料)以及報告區縣(城區=0，郊區=1)采用logistic回歸方程分析非結核分枝桿菌菌株流行病學資料的高危因素，結果發現：復治病人、報告區縣為城區將增加對于NTM分離的風險，年齡越大分離出NTM的風險越高(見表3)；從(圖1)可見NTM臨床分離比例較多的區縣主要集中在城區。

表2 2019年NTM組和TB組暴露因素的單因素比較[n(%)]

表3 2019年非結核分枝桿菌臨床分離株的多因素logistic回歸分析

圖1 81例NTM臨床分離株分離率在16個區縣的分段設色圖

三、 NTM臨床分離株不同類型菌種在常用抗結核藥物中的耐藥情況

經表型法進行初步菌群鑒定，分子生物學方法進行菌種鑒定后，分離出的81株NTM菌株用比例法對八種抗結核藥物(INH、RFP、SM、EMB、LFX、AK、CPM、PAS)進行藥敏試驗，81例NTM對上述八種藥物的耐藥率分別為97.53%、66.67%、91.36%、77.78%、61.73%、69.14%、74.07%、97.53%；其中對于異煙肼和對氨基水楊酸的耐藥率為最高；胞內分枝桿菌、鳥分枝分枝桿菌、膿腫分枝桿菌以及偶然分枝桿菌對于四種一線抗結核藥物均表現出較高的耐藥率，堪薩斯分枝桿菌對于INH、SM以及PAS表現出較高的耐藥率(表4)。

表4 NTM臨床分離株不同菌種對常用藥物的耐藥率

討 論

隨著非結核分枝桿菌病的增多，NTM病已成為常見病[6]。由于NTM病臨床癥狀的不典型、影像學表現與結核分枝桿菌差異不大，容易造成誤診和漏診，又因其對傳統抗結核藥物耐藥性較高，如果使用抗結核藥品治療，不但效果不理想[7]，而且容易誤診為耐多藥結核病，給臨床診斷和治療帶來很大困擾，因此要重視分枝桿菌的菌種鑒定以及患者流行病學史的調查。目前，NTM的診斷仍以實驗室檢測結果作為診斷標準，本文NTM分離鑒定流程采用實驗室非結核分枝桿菌篩查推薦流程[4]，保障了結果的準確。

一、NTM分離率及菌種分布

近年來非結核分枝桿菌病呈現快速增長趨勢，引起了廣泛的關注。美國NTM肺病的發病率從2008年的3.13/10萬上升到2015年的4.73/10萬[8]。韓國NTM病的發病率從2008年的6.0/10萬上升到2016的19/10萬[9]，本次調查結果顯示，2019年北京16個區縣結防系統所提供的分枝桿菌臨床分離株中NTM分離率為6.5%，與北京地區此前報道的2009年的3.1%[10]相比有了顯著升高；從菌種分布看，本次研究鑒定出的81株NTM中涵蓋了9種菌種，排名前四位的分別為胞內分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和偶然分枝桿菌，此前報道的2009、2013年北京地區130株NTM鑒定結果為胞內分枝桿菌的分離率最高(39.2%)，其次為堪薩斯分枝桿菌(37.7)、鳥分枝桿菌(6.9%)、膿腫分枝桿菌(5.4%)和偶然分枝桿菌(3.0%)[11]，本次結果與以往結果相比，緩慢生長型比例雖然仍然高于快速生長型，但是從比例分配上來講，快速生長型NTM的比例有了顯著升高，說明北京地區從以胞內分枝桿菌為主，緩慢生長型占明顯優勢的格局已經發生改變，其中增長最快的NTM為膿腫分枝桿菌，以往多認為NTM為機會致病菌，水和土壤是它的重要傳播途徑，近年來通過對膿腫分枝桿菌進行全基因組測序后，發現一些肺纖維化患者感染的膿腫分枝桿菌菌株之間存在高度同源性，說明膿腫分枝桿菌可能存在人傳人的可能，應引起高度關注[12]。

二、危險因素分析

通過對2019年NTM分離株流行病學資料的危險因素進行分析發現，治療史、報告區縣和年齡對于NTM的發生影響較大，本研究顯示NTM可以發生在各個年齡階段，且隨著年齡的增長而增加，一般認為有肺部基礎疾病的人群更容易感染NTM[1]，隨著年齡的增長發生各種肺部疾病的概率會大幅度提高，從而更容易引起NTM的發生；從治療史上看，復治病人更容易引起NTM的發生，分析認為NTM在臨床診療過程中容易誤診為TB，且對常規抗結核藥物表現出不同程度的耐藥，治療效果多不理想，因而更不容易完全治愈；從地域分布上看，北京市的中東部地區NTM分離率明顯高于其他地區，中部地區為北京市的中心城區，與郊區相比人員密度更大，人口數量更多，隨著NTM病的增多，對于高危險地區更應引起關注，但目前區縣級的結防機構缺乏NTM的診斷手段，應加速區縣級防治所檢測的普及力度，提高醫務人員診斷意識，在NTM高發地區加強檢測。

三、NTM的藥物敏感性

多數NTM對于抗結核藥物耐藥，本次研究結果顯示81株NTM對一線、二線抗結核均有較高的耐藥性，特別是對一線抗結核藥物耐藥性更高，這與秦中華等報道的天津地區339株臨床分離株報道的耐藥情況基本一致[13]。NTM的藥物敏感性試驗目前沒有比較明確的推薦方法，雖然美國臨床與實驗室標準化研究所(CLSI)對于某些NTM菌種有推薦的藥物及臨界濃度，但這些方法仍有待臨床進行評判[14]，大多數體外藥敏結果與臨床療效的關系尚不明確[1]。盡管如此，NTM在治療前仍需要進行菌種鑒定，根據已經明確的相關性，進行個性化化療方案治療。另外，在臨床診療過程中，應重視NTM與耐藥以及耐多藥結核病的鑒別診斷，對于久治不愈的耐藥結核病患者應及時進行菌種鑒定，防止病人漏診、誤診。

綜上所述，北京地區NTM分離率有顯著增高，隨著快速生長型NTM所占比例的增高，NTM菌種分布由緩慢生長型占絕對優勢的格局已發生轉變；北京NTM分離率隨年齡的增長而增加，人口密集地區分離率較高；鑒于NTM對于絕大多數抗結核藥物都耐藥，臨床應注意與耐藥結核病的鑒別診斷，對于耐多藥以及廣泛耐藥的結核病患者，應及時進行分枝桿菌菌種鑒定。