老年克羅恩病患者血清微小RNA-215、微小RNA-335表達及與腸道菌群的相關性

王小全

（黑龍江省佳木斯市中心醫院 消化內科，黑龍江 佳木斯 154002）

克羅恩病為一種自身免疫性腸道疾病，有著病程長、易復發等特點，在我國發病率約1.4/10萬［1］。目前的醫療技術尚無法徹底治愈克羅恩?。?］，因此仍需對該病發病機理進行長期研究探索，以期對該病的診治提供幫助。近年來，克羅恩病發生發展中腸道菌群結構變化逐漸引起臨床工作者的重視，諸多學者認為腸道菌群失衡參與克羅恩病病情進展，可引起腸道細菌移位，促發炎癥反應［3］。微小RNA（microRNA,miR）是一類與諸多生命活動關系密切的單鏈非編碼RNA 小分子，在炎癥性腸病中發揮重要作用，隨著學者對miRNA 的不斷鑒定和探索，發現miR-215、miR-335均與克羅恩病的發病相關［4-5］。為此，本研究探討了老年克羅恩病患者血清miR-215、miR-335 表達及與腸道菌群的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

獲佳木斯市中心醫院醫學倫理委員會批準（批準號XYFY2018-KL002-01），并取得患者的知情同意。選擇2019 年4 月至2021 年4 月佳木斯市中心醫院收治的126 例克羅恩病患者為觀察組，男90 例；漢族99 例；體質量指數（22.72±3.75）kg/m2；年 齡60～85 歲，平 均（67.81±3.80）歲；病 程6～60 個 月，平 均（38.36±15.17）個月；吸煙史37 例，飲酒史51 例；病變部位：回腸57 例，結腸22 例，回結腸47 例；臨床類型：狹窄型31 例，穿透型19 例，非狹窄非穿透型76 例。同期體檢健康者100 例為對照組，男72 例；漢族79 例；年齡60～83 歲，平均（68.01±3.64）歲；體質量指數（22.80±3.51）kg/m2；吸煙史31 例，飲酒史42 例。兩組一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。納入標準：克羅恩病據《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2018 年·北京）》中有關診斷標準確診［6］；無其他腸道疾病；病程6 個月以上；肝、腎等重要臟器無功能異常。排除標準：合并甲狀腺功能疾??；合并凝血系統疾病；依從性差；病歷資料不全；合并自身免疫性疾??；合并惡性腫瘤；合并精神性疾?。缓喜确置诩膊?；近期有卒中史；入院前已接受相關治療；合并心血管疾病。

1.2 儀器與試劑

臺式低速血液離心機（上海信裕生物科技有限公司，型號XY-2637）；PCR 檢測儀（上海佑隆生物科技有限公司，型號DNAble@）；Baypure 通用型磁珠法總RNA 提取試劑盒（廣州灣區生物科技有限公司，批號WADM-48-K）；肝素鈉抗凝管（上海圻明生物科技有限公司，批號OX02832）；TaqMan miRNA 反轉錄試劑盒（哈爾濱新海基因檢測有限公司，批號D1803）；需氧培養基（北京百奧萊博科技有限公司，批號SNM542-QZV）；厭氧培養基（上海赫澎生物科技有限公司，批號BR038）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 入院次日清晨，空腹取5 mL 外周靜脈血，3 000 r/min 離心10 min，取上清液，冰箱保存待測。取新鮮糞便0.5 g，依據10 倍稀釋法稀釋至10-8，留取10 μL，冰箱保存待測。

1.3.2 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction,RTPCR）實驗［7］采用總RNA 提取試劑盒對血清中的總RNA 予以提取，對總RNA 濃度予以測定，再經反轉錄獲得cDNA，以此cDNA 為模板在相關儀器上進行PCR 擴增。PCR 擴增體系共10 μL，其中包含cDNA 1 μL、MiScript SYBR Green Mix 5 μL、上下游引物各0.5 μL 及雙蒸水3 μL。PCR反應條件：95℃預變性90 s，95℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸15 s，總共40 個循環。擴增產物凝膠電泳，采集電泳照片，對各擴增條帶吸光度值進行測定。miR-215 或miR-335 相對表達量=miR-215 或miR-335 擴增條帶吸光度值/U6 擴增條帶吸光度值×100%。

1.3.3 腸道菌群數量檢測［8］將10 μL 糞便稀釋液，大腸桿菌和腸球菌采用需氧培養基予以培養，乳酸桿菌和雙歧桿菌采用厭氧培養基予以培養，溫度設置在37℃條件下，連續培養48 h，計數菌落數。通過革蘭染色、生化對細菌進行鑒定，然后計算每克糞便含菌群數（CFU/g），數據結果用對數形式表示。

1.4 觀察指標

①比較2 組血清miR-215、miR-335 相對表達量；②比較2 組腸道菌群數量；③比較緩解期和活動期患者血清miR-215、miR-335 相對表達量；④采用Spearman 檢驗分析miR-215、miR-335 與克羅恩病疾病活動度的相關性；⑤采用Pearson 檢驗分析miR-215、miR-335 與克羅恩病患者腸道菌群的相關性。

1.5 統計學方法

本研究數據的統計分析在SPSS 22.0 軟件上進行。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman 和Pearson 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清miR-215、miR-335 相對表達量比較

血清miR-215、miR-335 在觀察組中的相對表達量較對照組均顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組血清miR-215、miR-335 相對表達量（）

表1 兩組血清miR-215、miR-335 相對表達量（）

2.2 兩組腸道菌群數量比較

觀察組乳酸桿菌數量和雙歧桿菌數量顯著少于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），觀察組腸球菌數量和大腸桿菌數量顯著多于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組腸道菌群數量比較（,lgCFU/g）

表2 兩組腸道菌群數量比較（,lgCFU/g）

2.3 緩解期和活動期患者血清miR-215、miR-335相對表達量分析

根據簡化克羅恩病活動指數（Crohn's disease activity index,CDAI）［9］將126 例克羅恩病患者分為緩解期組（CDAI≤4 分，43 例）與活動期組（CDAI＞4 分，83 例）?；顒悠诨颊哐錷iR-215 相對表達量（0.28±0.06）顯著低于緩解期患者（0.99±0.40），差異有統計學意義（t=-11.572,P＜0.05），活動期患者血清miR-335 相對表達量（0.31±0.09）顯著低于緩解期患者（0.93±0.46），差異有統計學意義（t=-8.752,P＜0.05）。見圖1。

圖1 緩解期和活動期患者血清miR-215、miR-335 相對表達量

2.4 miR-215、miR-335 與克羅恩病疾病活動度的Spearman 相關性

miR-215、miR-335 與克羅恩病疾病活動度均呈負相關（r=-0.640,P＜0.001；r=-0.702,P＜0.001）。見圖2。

圖2 miR-215、miR-335 與克羅恩病疾病活動度的相關性

2.5 miR-215、miR-335 與克羅恩病患者腸道菌群的Pearson 相關性

miR-215、miR-335 與克羅恩病患者乳酸桿菌數量和雙歧桿菌數量均呈正相關（P＜0.05），miR-215、miR-335 與克羅恩病患者腸球菌數量和大腸桿菌數量均呈負相關（P＜0.05）。見表3。

表3 miR-215、miR-335 與克羅恩病患者腸道菌群的相關性

3 討論

miRNA 為一種微小RNA 分子，起始于細胞核且成熟于細胞質，由約20 個堿基構成，在真核細胞中廣泛存在，在人體腦脊液、血液、尿液、唾液等體液內均能表達，miRNA 可與蛋白質等物質構成復合物，抑制RNA 酶降解，因此miRNA 在體液中有著較強的穩定性及保守性［10］。該分子能與靶mRNA 互補結合，進而阻止其翻譯，調控基因表達，還在細胞生物學行為（凋亡、增殖、分化等）及炎癥性疾病、感染性疾病、消化系統疾病等疾病中發揮十分重要的作用［11］。miRNA 在健康人群中的表達譜基本一致，但該分子在不同疾病發病狀態下的表達譜會出現異常變化，此種變化通常早于影像學和生化改變，因此miRNA 在多種疾病早期診斷中具有潛在應用價值［12-13］。miRNA 能夠對機體內60%基因予以調節，miR-215、miR-335 是近年來新發現的miRNA，已有研究證實兩個分子可介導某些代謝通路而影響克羅恩病的發生及發展［14-15］。miR-335 定位于人類染色體7q32.2，具有調節人干細胞增殖、分化及遷移的作用。報道顯示［16］，miR-335 在潰瘍性結腸炎中表達水平出現下調，在潰瘍性結腸炎病情進展過程中發揮著重要作用。研究發現［17］，miR-335 表達水平與克羅恩病患者病變嚴重程度有關，可作為患者病變嚴重程度的評估指標之一。miR-215 定位于人類染色體1q41，動物模型實驗結果顯示［18］，miR-215 在克羅恩病小鼠模型中表達量明顯減少，提示miR-215 分子可能參與了克羅恩病的發病過程，為了進一步探索miR-215 對克羅恩病的影響，該研究通過灌腸給予模型小鼠miR-215 過表達的腺病毒載體進行干預，發現miR-215 過表達能夠顯著降低小鼠CDAI 評分值，改善結腸組織病理損傷，減少白細胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）等促炎因子釋放，表明miR-215 與克羅恩病存在密切聯系。上述報道與本次研究結果相吻合，本研究中血清miR-215、miR-335 在觀察組中的相對表達量較對照組均顯著減低，提示血清miR-215、miR-335 在老年克羅恩病患者中呈低表達水平；活動期患者血清miR-215、miR-335 相對表達量顯著低于緩解期患者，提示miR-215、miR-335 可能與克羅恩病疾病活動度均呈負相關，Spearman 相關性分析數據結果亦證實了這一結論。

克羅恩病為一種慢性炎癥性腸道疾病，腸道微生態與腸道黏膜免疫的異常變化可引起腸道慢性炎癥，而腸道慢性炎癥狀況下腸道微生態失衡現象亦可加重，病情如此反復，難以治愈［19］。因此，通過調節腸道菌群紊亂異常狀態，使正常腸道微生態重新恢復，是治療克羅恩病的重要手段之一?，F臨床已有糞便移植應用于治療頑固性克羅恩病患者的報道，報道中相關數據顯示患者獲得良好療效［20］。本研究顯示，觀察組乳酸桿菌數量和雙歧桿菌數量顯著少于對照組，觀察組腸球菌數量和大腸桿菌數量顯著多于對照組，提示克羅恩病患者腸道菌群存在紊亂異常狀態。本次研究Pearson 檢驗分析顯示，miR-215、miR-335 與克羅恩病患者乳酸桿菌數量和雙歧桿菌數量均呈正相關，與腸球菌數量和大腸桿菌數量均呈負相關，可能是由于血清miR-215、miR-335 表達水平變化可改變腸道菌群結構，故而動態監測2 項指標水平變化情況，將有利于及時調節患者腸道菌群結構，有效地改善腸道炎癥狀態，加強機體腸上皮屏障作用，進而抑制克羅恩病病情進展。

綜上所述，老年克羅恩病患者血清miR-215、miR-335 呈低表達水平，其水平與疾病活動度及腸道菌群具有一定相關性，這兩項指標有望成為克羅恩病診治的相關指標之一。但本次研究隨訪時間較短，有待延長時間進一步觀察其預后。