生物標(biāo)志物ADH1C、PCK1、MARCO在急性闌尾炎診斷中的作用

史偉山，王定一，廖新偉

（1.泌陽白云山中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 普外科，河南 駐馬店 463700；2.駐馬店市中心醫(yī)院 普外科，河南 駐馬店 463000）

急性闌尾炎是引起腹痛的最常見原因之一，國(guó)內(nèi)每年有近75 萬次急診和25 萬次闌尾切除術(shù)。在全球范圍內(nèi)，小部分手術(shù)是“陰性闌尾切除術(shù)”，因誤診導(dǎo)致切除非發(fā)炎的闌尾［1］。目前CT掃描是診斷闌尾炎的“金標(biāo)準(zhǔn)”，對(duì)孕婦來講，磁共振成像（MRI）可作為合理的替代檢查，而超聲波檢查可作為初步診斷的替代檢查［2-3］。雖然CT掃描是闌尾炎最敏感和最特異的診斷工具，但具有顯著的輻射暴露問題，在兒童群體中尤其值得關(guān)注，因?yàn)樗麄兏菀资艿捷椛浔┞兜挠绊憽＃?］。為減少CT 掃描的損害，幾個(gè)臨床試驗(yàn)正在檢驗(yàn)低劑量輻射的診斷效用［5-6］。而關(guān)于血液生物標(biāo)志物對(duì)急性闌尾炎的診斷相關(guān)的研究較少，本研究為找到急性闌尾炎的血液生物標(biāo)志物，分析了闌尾炎患者和非炎癥腹痛患者的微陣列圖譜。為驗(yàn)證這些生物標(biāo)志物在急性闌尾炎患者診斷中的作用，本文對(duì)急診室腹痛患者的血液樣本進(jìn)行了蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)，以期將使用血液生物標(biāo)志物作為一種急性闌尾炎預(yù)篩選方法成為可能。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020 年1 月至2021 年6 月在泌陽白云山中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院急診科住院的80 例腹痛患者作為研究對(duì)象。其中最終確診為急性闌尾炎的患者46 例為闌尾組，其他原因腹痛的患者34 例為對(duì)照組。闌尾組男23 例，女23 例；年齡18～67 歲，平均（43.37±15.25）歲；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）（22.15±1.25）；血白細(xì)胞計(jì)數(shù)（10.6±1.52）×109/L；長(zhǎng)期吸煙者23 例。對(duì)照組男17 例，女17 例；年齡18～65 歲，平均（43.46±15.83）歲；BMI（22.32±1.23）；血白細(xì)胞計(jì)數(shù)（10.8±1.48）×109/L；長(zhǎng)期吸煙者17 例。兩組基線資料如性別、年齡、BMI、血白細(xì)胞計(jì)數(shù)及吸煙情況等比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。該臨床研究符合赫爾辛基宣言，并通過醫(yī)院倫理審查。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①正在接受急性腹痛評(píng)估的患者，包括闌尾炎或疑似腸炎和/或缺血；②闌尾組患者最終由手術(shù)及病理證實(shí)為急性闌尾炎；③年齡大于18 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①病危的患者；②導(dǎo)致腹痛的全身惡性疾病患者；③孕婦。

1.3 方法

1.3.1 差異性基因表達(dá) GSE9579 陣列的心臟基因表達(dá)譜和相關(guān)臨床數(shù)據(jù)可從Gene Expression Omnibus（GEO,https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載。從診斷為急性闌尾炎的患者中取出的9 個(gè)闌尾樣本和因非炎癥原因取出的4 個(gè)樣本中評(píng)估了基因表達(dá)［7］，在每個(gè)樣本的遠(yuǎn)端獲得一塊圓周組織，根據(jù)基因表達(dá)譜篩選候選因子；使用Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array 微陣列測(cè)量基因表達(dá)。另外，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)的蛋白質(zhì)|logFC|＞1 和adj.P＜0.001。

1.3.2 基因富集分析 KEGG 富集分析使用"clusterProfiler"R 包對(duì)上述差異基因進(jìn)行通路富集分析。

1.3.3 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）使用在線STRING 對(duì)差異基因進(jìn)行PPI 分析，并將其可視化，然后使用R 語言進(jìn)行節(jié)點(diǎn)分析。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）①主要試劑：人ADH1C-ELISA 試劑盒購(gòu)自上海斯信生物科技有限公司，PCK1-ELISA 試劑盒購(gòu)自上海雙贏生物科技有限公司，MARCO-ELISA 試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司。②主要儀器：離心機(jī)（濟(jì)南江雪醫(yī)療器械有限公司），恒溫箱（北京福意電器有限公司），酶標(biāo)儀（濟(jì)南貝思網(wǎng)絡(luò)技術(shù)有限公司）。③實(shí)驗(yàn)方法：采集所有研究對(duì)象的空腹靜脈血，靜置分層后，4℃低溫離心機(jī)中以3 000 r/min 離心10 min，上層即為血清；根據(jù)相應(yīng)的ELISA 試劑盒說明書測(cè)定各組患者血清中酒精脫氫酶1C（ADH1C）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PCK1）、膠原結(jié)構(gòu)巨噬細(xì)胞受體（MARCO）的含量。

1.4 觀察指標(biāo)

所有患者均于入組后次日清晨8:00—9:00 空腹?fàn)顟B(tài)下抽取外周靜脈血，通過ELISA 法檢測(cè)血清中ADH1C、PCK1、MARCO 的水平。

檢驗(yàn)效能采用受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線分析，ROC 曲線用于選擇最佳診斷界限值，曲線越靠近左上角，準(zhǔn)確性越高。本研究只展現(xiàn)曲線下面積（area under curve,AUC），其用于判斷各檢測(cè)指標(biāo)的診斷效能：AUC＞0.9，為診斷準(zhǔn)確性優(yōu)；0.9＞AUC＞0.7，為診斷準(zhǔn)確性良好；0.7＞AUC＞0.5，為診斷準(zhǔn)確性差；0.5＞AUC，為診斷準(zhǔn)確性無臨床意義。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（）表示，行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因表達(dá)譜篩選候選因子

從GSE25765 數(shù)據(jù)集中，進(jìn)行闌尾炎組與對(duì)照組的差異性基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADH1C、PCK1顯著下調(diào)，而MARCO 顯著上調(diào)，見圖1A。圖1B顯示了利用熱圖將差異基因在每個(gè)樣本中表達(dá)水平的矩陣。

圖1 基因表達(dá)譜篩選候選因子

2.2 差異表達(dá)基因的相關(guān)功能

KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)這些差異基因參與P450-藥物代謝、酪氨酸代謝、丙酮酸代謝、類固醇激素生物合成及PPAR 信號(hào)通路等生物學(xué)功能。此外，利用在線string 工具可視化上述差異基因間的蛋白-蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network,PPI），其中ADH1C 與其它蛋白節(jié)點(diǎn)間的連線最多，ADH1C 的中心性最高，提示與其它蛋白聯(lián)系緊密，見圖2。

圖2 差異表達(dá)基因的相關(guān)功能

2.3 兩組患者血清中ADH1C、PCK1、MARCO含量的比較

與對(duì)照組相比，闌尾組患者血清中ADH1C、PCK1 含量顯著均較低，MARCO 含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組患者血清中ADH1C、PCK1、MARCO 含量比較（n=40,）

表1 兩組患者血清中ADH1C、PCK1、MARCO 含量比較（n=40,）

2.4 各檢測(cè)指標(biāo)對(duì)急性闌尾炎的診斷性能

血清ADH1C、PCK1、MARCO 水平對(duì)急性闌尾炎分別具有良好的診斷性能（AUC 值＞0.07），見表2。

表2 各檢測(cè)指標(biāo)對(duì)急性闌尾炎的診斷性能

3 討論

闌尾炎是一種炎癥性疾病，類似于憩室炎或結(jié)腸炎，但某些血液生物標(biāo)志物的激活是不同的［8］。血液中蛋白的變化模式有助于更好的從生物標(biāo)志物層面理解急性闌尾炎的病因，有研究認(rèn)為微生物組16S 區(qū)的下一代測(cè)序（NGS），充分表明了梭桿菌的變化與闌尾炎有關(guān)［9］。梭桿菌是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，可以通過產(chǎn)生丁酸（丁酸鹽）而引起鄰近宿主細(xì)胞的毒性反應(yīng)和小鼠的結(jié)腸炎樣癥狀。也有研究試圖開發(fā)血液中闌尾炎的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，如膽紅素、C-反應(yīng)蛋白（CRP）和降鈣素原（PCT）等。然而對(duì)這些生物標(biāo)志物的研究難以找到理想的臨床預(yù)測(cè)模型。WBC，CRP 和MRP8/14（S100A8/S100A9）的組合顯示對(duì)急性闌尾炎的敏感度為96%，但特異度為43%［10］。同樣，在急性闌尾炎中，由血清淀粉樣蛋白（SAA），髓過氧化物酶（MPO）和MMP9 血漿蛋白水平建立的多變量模型的診斷率低于主要臨床模型（ROC=0.71vs.0.91 臨床模型）［11］。本研究前期通過分析闌尾炎GEO 芯片，發(fā)現(xiàn)表達(dá)異常的基因ADH1C、PCK1、MARCO，可能是闌尾炎的潛在生物標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)血清ADH1C、PCK1 水平在急性闌尾炎患者中呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)，且具有一定的診斷價(jià)值。這與ADH1C 是潰瘍性結(jié)腸炎最顯著下調(diào)的差異性表達(dá)基因（DEGs），并且ADH1C 的過表達(dá)可以明顯減少白細(xì)胞介素（IL）-6 和IL8 產(chǎn)生的結(jié)論較為一致［12］，可能為治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛在靶點(diǎn)。腸道血管屏障（gut-vascular barrier,GVB）的高滲透性在腸道源性敗血癥中起作用，而PCK1在改善GVB 的機(jī)制中起重要作用［13］。與我們的研究結(jié)果基本一致，PCK1 的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致腸道血管屏障的失調(diào)，從而導(dǎo)致闌尾炎癥的發(fā)生。

有研究證實(shí)證實(shí)肺部炎癥組織中MARCO 水平升高［14］。MARCO 作為跨膜受體，除了吞噬作用外，還是一種粘附質(zhì)膜受體，它可通過巨胞飲和內(nèi)吞途徑將各種細(xì)胞外物質(zhì)摻入細(xì)胞中發(fā)揮作用［15］。此外，靶向肺癌中免疫抑制性巨噬細(xì)胞的MARCO 和IL37R 可阻斷調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞并支持細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞功能［16］。巨噬細(xì)胞被吸引到黏膜炎癥部位，是正常維持屏障功能的主要組成部分，它們對(duì)腸道微環(huán)境中的各種可溶性信號(hào)有反應(yīng)，包括缺氧［17］。

目前在市場(chǎng)上用于乳腺癌進(jìn)展［70 基因預(yù)測(cè)標(biāo)記（MammaPrint，Agendia，荷蘭），21 基因復(fù)發(fā)評(píng)分（Oncotype DX，美國(guó)）］、移植排斥反應(yīng)（AlloMap，美國(guó)）和冠狀動(dòng)脈疾病（CorusCAD）的生物標(biāo)志物測(cè)試產(chǎn)品較多，本研究同樣評(píng)估了血液潛在生物標(biāo)志物對(duì)闌尾炎的診斷效能，認(rèn)為盡管蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物會(huì)由于其他高豐度蛋白質(zhì)的干擾而難以測(cè)量，但相對(duì)于mRNA 標(biāo)志物來說，其檢測(cè)相對(duì)較快、易于應(yīng)用于臨床，因而仍然具有開發(fā)價(jià)值。

綜上所述，闌尾細(xì)菌生物膜可能是闌尾炎的一個(gè)重要病理生理機(jī)制，ADH1C、PCK1、MARCO在急性闌尾炎患者中變化顯著，對(duì)急性闌尾炎的臨床診斷具有一定指導(dǎo)意義。