原兒茶酸通過促進線粒體活性氧堆積調控急性髓細胞性白血病細胞增殖與凋亡的作用機制研究

廖中廷，樊成偉，張發蓉，魏 靜，殷世玉，胡瓊英

(1.四川省資陽市人民醫院血液內科，四川 資陽 641300；2.成都中醫藥大學附屬醫院檢驗科，四川 成都 610072)

急性髓細胞性白血病 (acute myelocytic leukemia, AML)是人骨髓髓系干細胞前體的惡性腫瘤，在成人急性白血病中最為常見[1]。隨著蛋白組學、代謝組學和表觀遺傳學的發展，AML的靶向研究日益受到關注；最新證據表明，AML細胞對線粒體功能的依賴性是AML細胞異質性的能量來源，這一發現為AML的研究提供了新視角[2,3]。原兒茶酸 (protocatechuic acid, PCA)是原花青素、花青素等復合多酚類化合物的主要代謝產物，具有抗炎、抗氧化、抗癌等藥理活性作用[4,5]。研究顯示PCA可通過降低線粒體膜電位的消散、激活caspase-9和caspase-3及降低磷脂酰絲氨酸暴露，抑制過氧化應激誘導的血小板凋亡[6]。隨著PCA抗腫瘤作用的研究進展，其在血液系統疾病中的應用日益引起人們的重視，但相關研究仍較少。本實驗旨在探明PCA對AML細胞系HL60和KG-1α的細胞活性及線粒體功能的影響，以期為AML的發生提供新的證據，為AML靶向線粒體治療提供新的候選藥物。

1 材料與方法

1.1 材料本研究于2020年6～12月在成都中醫藥大學附屬醫院中心實驗室完成，所需細胞和試劑分別為：人髓系白血病細胞系HL60和KG-1α(飛鷗爾生物，成都)，細胞培養基MEM(Life Technologies，美國)，澳洲胎牛血清(Gibco，美國)，原兒茶酸(Sigma公司，美國)。

1.2 方法①細胞培養及CCK-8檢測細胞活力。復蘇HL60和KG-1α細胞后先加入含10%的胎牛血清培養基RPMI 1640，在37 ℃、5% CO2培養箱內培養3天后換液。對細胞懸浮、沉淀并計數，之后于96孔板上接種2×104個細胞/孔，加入不同濃度的PCA分別處理24 h后分析。為了檢測細胞活性，96孔板上接種2×103個細胞/孔，與10 μmol/L PCA共同孵育，在1～5天內每天加入10 μl CCK-8試劑，4 h后檢測OD450的吸光度并繪制生長曲線。②流式細胞術檢測細胞周期。不同濃度的PCA分別處理HL60和KG-1α細胞24 h后，用溴化乙錠(PI)染色并進行流式細胞分析檢測HL60和KG-1α細胞周期。③免疫印跡(Western blot)法分析細胞凋亡相關蛋白。用10 μmol/L PCA分別處理HL60和KG-1α細胞24 h后收集蛋白，應用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離20 μg總蛋白(細胞凋亡相關蛋白C-PARP、 C-Caspase-3和Caspase-3)，先用PVDF膜轉移免疫印跡，再使用5%的牛血清白蛋白PBS封閉；將1∶1000稀釋后的抗體，加至PVDF膜，然后再室溫孵育1 h。將PVDF膜用預冷的T-PBS清洗，再將1∶5 000稀釋后的辣根過氧化物酶偶聯抗兔二抗與PVDF膜室溫孵育30 min，T-PBS清洗3次后，曝光。④細胞活性氧(Reactive oxygen species, ROS)檢測。10 μmol/L PCA分別處理HL60和KG-1α細胞24 h，加入10 μmol/L MitoSOX熒光染料，在室溫避光條件下孵育10 min，棄去上清液，再加入預冷的5 ml PBS清洗三次后用熒光顯微鏡觀察。

1.3 統計學方法應用SPSS 18.0統計軟件對數據進行分析。計量數據以均數±標準差表示，組間差異采用student-t檢驗和單向方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCA對AML細胞增殖活性的抑制情況細胞活力結果顯示HL6和KG-1α細胞對PCA化療敏感，PCA對HL60和KG-1α細胞作用的IC50分別是(21.73±0.2) μmol/L和(16.93±0.7) μmol/L；10 μmol/L PCA同時處理HL60和KG-1α 5天后，結果發現PCA可顯著抑制細胞活力(P<0.05)，見表1。

表1 PCA處理HL60和KG-1α細胞1～5天抑制細胞活力比較

2.2 PCA對AML細胞凋亡的促進情況流式細胞術檢測細胞凋亡情況發現：與對照組相比，PCA處理組可顯著促進AML細胞HL60和KG-1α凋亡，見圖1；與之相似，在圖2中，Western blot檢測凋亡相關蛋白剪切形式的caspase-3(C-caspase-3)和PARP(C-PARP)在PCA處理組中明顯增加。

圖1 PCA促進HL60和KG-1α細胞凋亡的流式細胞圖 a:AML細胞系HL60對照組；b:20 μmol/L PCA處理AML細胞系HL60組；c:AML細胞系KG-1α對照組；d:15 μmol/L PCA處理AML細胞系KG-1α組

圖2 PCA對AML細胞HL60和KG-1α促凋亡作用的蛋白免疫印跡圖

2.3 PCA對AML細胞線粒體ROS堆積的促進情況對HL60和KG-1α細胞質ROS進行MitoSOX染色，結果表明：與對照組相比，PCA處理組細胞內的線粒體ROC堆積明顯增多，加入ROS清除劑N-半胱氨酸(NAC)后，該現象被逆轉，見圖3；同時，流式細胞術檢測細胞凋亡情況，發現NAC加入后，PCA引起的細胞凋亡下降。見圖4。

圖3 PCA促進AML細胞HL6和KG-1a線粒體ROS堆積的熒光顯微圖 a:AML細胞系HL60對照組；b:20 μmol/L PCA處理AML細胞系HL60組；c:20 μmol/L PCA處理AML細胞系HL60后+10 μmol/L NAC組；d：AML細胞系KG-1α對照組；e：15 μmol/L PCA處理AML細胞系KG-1α組；f:15 μmol/L PCA處理AML細胞系KG-1α后+10 μmol/L NAC組

圖4 PCA促進AML細胞HL6和KG-1a線粒體ROS堆積的流式細胞圖 a:AML細胞系HL60對照組；b:20 μmol/L PCA處理AML細胞系HL60組；c:20 μmol/L PCA處理AML細胞系HL60后+10 μmol/L NAC組；d：AML細胞系KG-1α對照組；e：15 μmol/LPCA處理AML細胞系KG-1α組；f:15 μmol/L PCA處理AML細胞系KG-1α后+10 μmol/L NAC組

3 討論

近年來AML的治療取得了長足發展，但復發問題仍十分棘手。針對復發/難治性AML的治療目前尚無標準，化療是常見的治療方案；含阿糖胞苷等新化療方案雖可提高復發/難治性AML的緩解率，但OS獲益仍小于1年；以FLAG方案為代表的化療方案，治療毒性較強，常伴有嚴重的血液學事件和感染[7,8]。目前學術界普遍認為HSCT是唯一具有治愈復發/難治性AML的潛在方法，但移植條件苛刻，移植后并發癥難以控制[9]。新型靶向藥物的出現為AML治療提供了更多、更高效的選擇，因此不斷探索新的靶位點，成為AML治療的研究熱點[10]。

PCA是花青素的主要代謝產物之一，有較強的抗氧化活性[11]。Han等將PCA處理的內皮細胞與棕櫚酸處理的細胞相比，發現PCA顯著降低了內皮細胞氧化損傷的兩個生物標志物3-硝基酪氨酸和8-羥基脫氧鳥苷，同時明顯降低了細胞內ROS水平[12]。PCA也具有顯著的腫瘤抑制作用，在一項結直腸癌的治療研究中，研究者發現PCA通過氧化/抗氧化失衡，呈劑量依賴型顯著降低結直腸癌的細胞活力；PCA在癌細胞中誘導了促氧化作用，通過調節氧化還原平衡和抑制HO-1系統導致p21激活介導結直腸癌細胞的凋亡[13]。已明確PCA的抗氧化功能和抗癌作用，但PCA在血液惡性疾病的作用研究報道較少，尤其是對線粒體的功能探索尚不明確，而后者對腫瘤的生存至關重要；目前靶向線粒體的抗腫瘤藥物較多，但對于血液系統惡性疾病尤其是AML仍需探索篩選。

本研究通過探索PCA對AML細胞增殖、凋亡情況，揭示PCA對AML細胞活性的抑制作用。實驗結果顯示，與對照組相比PCA能顯著抑制AML細胞HL6和KG-1a的增殖活性，同時促進HL6和KG-1a的凋亡，促進細胞凋亡相關蛋白的剪切。為了進一步闡釋PCA抗腫瘤的機制，我們又檢測了PCA作用AML細胞HL6和KG-1a后，細胞內線粒體的ROS變化情況，發現PCA的處理能引起細胞內ROS堆積，而這種現象可被ROS清除劑NAC逆轉，且NAC的加入還能抑制PCA引起的HL6和KG-1a細胞凋亡。以上結果說明PCA引起的HL6和KG-1a細胞凋亡是通過增加細胞內線粒體ROS堆積造成。

綜上，PCA抑制AML細胞活性是通過促進細胞內線粒體ROS生成所致，這與國內外已有的研究一致。通過明確PCA的抗AML作用，探討其作用機制和靶點，可為AML的治療提供新的思路。