微管相關蛋白1輕鏈3、叉頭框蛋白Q1、生存素在食管鱗狀細胞癌中的表達及對術后復發的預測價值

彭鳳翔，高蓉梅，李永春，葉小娟

(武警四川省總隊醫院，四川 樂山614000)

近年來食管狀細胞癌發生率有不斷增加的趨勢，其可劃分為鱗狀上皮細胞癌(ESCC)及腺癌兩種類型，ESCC發病率高達90%左右[1]。該疾病在滿足手術條件時應該優先選擇手術切除治療，可以切除病灶組織，但術后復發的風險比較高。尋找預后相關基因，預測ESCC術后復發的發生，成為了當下研究的關注點[2]。微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)編碼蛋白可用于對細胞自噬進行判斷，在腫瘤的病理變化具有重要的調控作用[3，4]。叉頭框蛋白Q1(FOXQ1)是結構中有叉頭框結構的高保守轉錄因子，其和腫瘤的生物活動密切相關[5]。生存素(Survivin)在腫瘤細胞凋亡中可起到一定抑制作用，可促進腫瘤生長[6]。本文基于蛋白質印跡法檢測LC3、FOXQ1、survuvin表達對患者行食管鱗癌根治術后復發的預測價值，為預后評估提供支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料2018年3月至2020年3月我院行手術治療的86例ESCC患者，納入標準：①滿足食管癌診斷標準[7]； ②術前都沒有給予手術外的其他治療；③患者不存在精神障礙；④對相關研究情況知情同意。排除標準：①精神異常，無法正常交流; ②存在嚴重的心、腦相關臟器功能障礙；③同時進行放化療。男62例，女24例，年齡45～80歲。病理組織低、中、高分化分別為30、24、32例；TNM分期Ⅰ～Ⅲ期分別為20、22、44例；腫瘤部位上段36例，中段27例，下段23例；合并淋巴結轉移30例，無淋巴結轉移56例。兩組一般資料比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

1.2 方法主要試劑：兔抗人LC3、FOXQ1及Survivin相關的單抗全部來源于Abcam公司；GAPDH單克隆抗體(上海江萊公司)；對應的特異性引物通過上海生工合成，相關情況見表1。Trizol試劑、DAB試劑盒(上海江萊公司)；BCA試劑盒(北京中科公司)。實時熒光定量逆轉錄-PCR：采集癌組織、癌旁組織作為樣本，-70 ℃保存。裂解法提取樣本中總RNA，經反轉錄獲得逆轉錄cDNA，條件如下：在 37 ℃培育15 min，85 ℃， 5 s。依據Direct PCR Kit規范進行擴增處理。采用2-△△Ct法測定LC3、FOXQ1、survuvin相對表達量。免疫印跡法檢測：裂解法提取樣本中總蛋白，經凝膠電泳處理后轉膜，室溫下封閉1 h后，加入LC3、FOXQ1、survuvin一抗(均進行千倍稀釋)后4 ℃搖床培育十二小時，加入標記的二抗后接著根據要求培養1 h；洗膜，成像對所得影像結果通過Quantity-one工具處理，確定吸光度，然后把結果相除計算出其與GAPDH的比值為相對表達量。

表1 PT-PCR引物序列

1.3 統計學方法應用SPSS 22.0統計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差描述，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；應用ROC曲線分析LC3、FOXQ1、survuvin對術后復發的預測價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ESCC癌組織中蛋白表達與癌旁組織相比，癌組織中的LC3 mRNA水平更低，其余兩個相對表達量高(P<0.05)。蛋白質印跡法結果表明，與癌旁組織相比，癌組織中的LC3水平低，而FOXQ1、survuvin兩種蛋白的表達水平高(P<0.05)。見圖1。腫瘤浸潤深度為T3～T4、分化程度為低分化、TNM分期為Ⅲ期和有淋巴結轉移患者癌組織中LC3蛋白表達水平低于腫瘤浸潤深度為T1～T2、分化程度為中高分化、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結轉移患者，FOXQ1和survuvin蛋白表達水平高于腫瘤浸潤深度為T1～T2、分化程度為中高分化、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結轉移患者(P<0.05)，見表2。

圖1 食管鱗癌根治術標本LC3、FOXQ1和survuvin表達 a:蛋白表達圖譜；b:mRNA相對表達量；c:蛋白相對表達量

表2 不同臨床病理特征患者癌組織中三種蛋白表達水平的比較

2.2 復發和未復發患者LC3、FOXQ1、survuvin蛋白表達水平比較術后隨訪12個月，復發患者26例(30.23%)，復發患者LC3蛋白水平低于未復發者，FOXQ1、survuvin蛋白表達水高于未復發者(P<0. 05)。見表 3。

表3 復發和未復發患者LC3、FOXQ1、survuvin蛋白表達水平比較

2.3 LC3、FOXQ1、survuvin對術后復發的預測價值分析LC3、FOXQ1、survuvin及其聯合檢測預測食管鱗狀細胞癌根治術后復發的AUC分別為0.660、0.704、0.785、0.903，聯合檢測的AUC最高(P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 LC3、FOXQ1、survuvin單獨應用與聯合應用的ROC曲線

表4 LC3、FOXQ1、survuvin三種指標及聯合指標的ROC曲線分析

3 討論

食管癌發生率有不斷增加趨勢，每年都有大量此類患者由于各種原因影響而死亡。根據臨床經驗可知這種疾病在發病初期階段沒有明顯的病癥，進食過程中會產生異物感。在發現很明顯梗阻情況下，一般可判斷病情已經很嚴重，進入了中晚期[8]。在這種疾病的臨床治療領域，常用的方法為食管癌根治術，根據實際的經驗可知這種治療方法的優勢為創傷小、恢復快，適用性強，患者接受度高。有的患者會出現局部復發相關的問題，這對其療效產生不良影響[9]。近年來一些學者研究發現腫瘤的發生機制很復雜，也受到自噬因素影響[10]。一些學者研究表明，食管癌腫瘤中自噬現象很普遍，有必要對此進行研究[11]。LC3為一種重要的自噬相關的基因，在檢測自噬水平方面有很高應用價值，也被當做為主要的標記物[12]。發生自噬情況下，LC3-Ⅰ被修飾和加工，且結合自噬膜表面特定的物質而形成LC3-Ⅱ，因而可以將其當做為一種特定的標記蛋白[13]。FOXQ1是重要的轉錄因子，其可以通過識別并結合下游靶基因的啟動子, 在此基礎上實現基因調節目的。這種蛋白可利用Wnt/β信號轉導通路參與惡性腫瘤細胞的侵襲活動[14]。survuvin是由細胞蛋白受體-1cDNA分離出來的，存在于細胞周期的G2/M期，通過有絲分裂加速細胞增殖，對其凋亡起到抑制作用，進而促進了腫瘤病理過程[15]。由此可見，LC3、FOXQ1及survuvin均參與了腫瘤細胞的各方面病理活動，且對病情進展有直接決定作用。

結果發現，和癌旁組織相比，癌組織中LC3蛋白和mRNA水平下降，而FOXQ1和survuvin的提高。由此可判斷出這三種基因的表達與這種腫瘤的病理活動有關。本研究分析了LC3、FOXQ1及survuvin表達水平與腫瘤病理特征的關系，結果表明，腫瘤浸潤深度為T3～T4、分化程度為低分化、TNM分期為Ⅲ期和有淋巴結轉移患者癌組織中LC3蛋白表達水平明顯降低，FOXQ1和survuvin蛋白表達水平明顯升高。楊燕[16]對此進行研究，其所得結果發現LC3蛋白在乳腺癌不同腫瘤分期和淋巴結轉移患者中表達水平存在顯著差異。崔曉海等[17]研究表明，胃癌組織中FOXQ1基因表達水平明顯提高，且其表達水平淋巴結轉移、腫瘤體積、及 TNM 分期等有關。Shi等[18]研究表明，survuvin表達與鼻咽癌患者的腫瘤分期、分化和轉移等有關。本研究結果與上述研究類似，表明LC3、FOXQ1及survuvin表達水平可以反映食管癌的腫瘤進展。在對患者進行術后12個月隨訪發現，復發患者LC3蛋白表達水平明顯降低；FOXQ1、survuvin蛋白表達水平顯著高于未復發者。且通過ROC曲線分析發現，LC3、FOXQ1及survuvin三指聯合檢測靈敏度、特異度最高，對患者行食管鱗癌根治術后復發具有預測價值。

綜上所述，食管鱗狀細胞癌組織中LC3低表達，FOXQ1、survuvin高表達，三者結合起來可更準確的進行術后復發率預測，為此類患者的治療提供支持。本研究納入的樣本量少，且未進行隨訪研究觀察患者生存情況，進行多中心大樣本分析，應對這三種基因影響作用的具體分子機制做進一步探究。