低溫等離子體在口腔微生物感染性疾病中的應用研究進展

孫小欽，王 旭，韓 琪,3，陳 宇,3△

(1.口腔疾病研究國家重點實驗室，國家口腔疾病臨床醫學研究中心，四川大學華西口腔醫學院，四川成都610041；2.四川大學機械工程學院，四川成都610041；3.四川大學華西口腔醫院口腔病理科，四川成都610041)

口腔富含微生物，口腔微生物組是“表示共生，和病原微生物共生的生態群落，實際上共享我們的身體空間，為健康和疾病的決定因素”，當口腔微生物群失去穩態時會導致一系列微生物感染性疾病[1]。免疫系統可協調維持宿主與微生物之間的平衡，但找尋一種新型的口腔抗感染方法是當前該領域的研究方向。20世紀90年代，等離子體抗菌在醫用研究上取得很大進度。低溫等離子體(cold atmospheric plasma, CAP)通過向氣體提供能量誘導電離產生，形成活性氧和氮物質(reactive oxygen and nitrogen species ，RONS)等部分電離氣體[2]。當微生物直接暴露于CAP時，RONS綜合協同作用滅活[3]。CAP可調節與氧化還原信號相關的多個細胞過程，活性氧(reactive oxygen species，ROS)的變化會觸發氧化還原敏感轉錄因子協同作用[2]，促進有微生物導致的口腔創傷感染愈合。該文對CAP在口腔微生物感染性疾病中的應用做一概述。

1 CAP防治齲病應用

齲病與口腔微生物群落生態失調密切相關，膳食碳水化合物代謝持續產酸導致耐酸微生物增加，改變牙體硬組織表面pH穩態，打破脫礦-再礦化平衡[4]，導致牙無機物脫礦、有機物分解而形成齲。

1.1 CAP與口腔齲病相關浮游微生物等離子體應用牙科抗菌研究始于20世紀初期[2]。CAP對接種在不同介質(多孔介質如濾紙，光滑固體表面介質如載玻片，聚合物表面介質如牙釉質類似物)的變異鏈球菌和嗜酸乳桿菌均有較好的殺菌效果，但嗜酸乳桿菌的滅活時間比變異鏈球菌長。嗜酸乳桿菌的直徑比變異鏈球菌大，具有更高的等離子體耐受性，為了使單個細胞達到相同強度的等離子體射流，在相同條件下，CAP處理嗜酸乳桿菌的時間會更長。其次是在相似細胞群密度下，嗜酸乳桿菌的細胞層重疊比變異鏈球菌更多，CAP的活性物質被細胞外層阻擋而無法到達細胞的下層。革蘭氏陽性菌對CAP治療的敏感性低于革蘭氏陰性菌，這可能是由于革蘭氏陽性菌的肽聚糖層厚而堅韌。CAP中的活性物質可以破壞革蘭氏陽性細菌肽聚糖結構中的鍵和導致革蘭氏陰性細菌膜的脂質過氧化[5]。

1.2 CAP對生物膜的作用牙菌斑生物膜在齲病的發生上有重要作用。研究[6]發現氬/氧CAP處理2分鐘后顯著降低了血鏈球菌單一菌種和雙菌種生物膜中細菌的活力，降低幅度高達99%，其機制是通過降低細菌活力以及疏水性和共聚集能力來有效地滅活口腔細菌生物膜。氮基CAP處理后，羥基磷灰石盤(HA)上由人工唾液包被培養的生物膜被殺滅，同時HA表面形成具有羥基的新化合物，增加了表面的親水性，可能影響細菌的粘附和生長速度[7]。CAP對生長在修復樹脂復合材料表面的生物膜有抗菌效果，作用150秒后，細菌活力降低38.3%，同時能立即降低未破壞生物膜的代謝活性[8]。但生物膜去除方面存在局限性，其厚度可以減少CAP進入，防止CAP滲透到深層及對生物膜底部細菌的殺菌作用。此外，牙菌斑生物膜破壞程度與菌種組成和CAP氣體成分有相關性。

1.3 CAP與牙體硬組織再礦化提高牙齒再礦化能力也是防治齲病的有效手段，氟化物可以增強牙釉質的再礦化、抗菌、抗腐蝕。CAP處理后牙齒表面氟化物的保留改善，CAP和氟化物聯合治療組的牙釉質含氟量和鈣磷都比CAP未處理組高，說明CAP處理牙齒表面后對氟化物的吸收增加，提高了氟化物在牙釉質上的滯留率，導致牙釉質表面酸溶解度和脫鈣降低。氟化鈣樣沉積物在口腔的停留時間較短，而CAP處理后，作為活性氧物質的羥基自由基與牙齒表面相互作用改變表面特征，形成氟化鈣抑制牙釉質表面礦物質溶解。類釉質HA經過CAP處理后，氟保留得到改善，這可能與抗菌和抗生物膜作用增加相關[9]。CAP具有生物膜調節和氟化強化牙釉質雙重作用，可以預防和治療齲病。

2 CAP在牙髓炎和根尖周炎中的應用

根尖周病和牙髓疾病與口腔微生物感染密切相關，牙髓復雜的根管解剖結構和個體間牙本質小管形態的差異讓次氯酸鈉和氯己定對根管系統的所有部分充分消毒進行困難[10],CAP能深入到常規操作不能達到的根管腔隙中。

2.1 CAP對糞腸球菌的作用在牙髓感染和慢性根尖周炎中，糞腸球菌常被分離出來[11]。CAP對糞腸球菌浮游培養物具有良好的殺菌效果，且CAP處理時間變長時進一步提高了殺滅效果。CAP對年輕或者成熟(培養48小時或72小時)的生物膜具有顯著抗菌功效，通過核酸釋放的光譜測量發現處理后細胞質膜沒有損傷，表明CAP主要作用機制似乎不是膜損傷。氦/氧等離子體對糞腸球菌生物膜的殺菌作用強于純氦等離子體[12]。在次氯酸鈉使用后輔助使用CAP處理糞腸球菌生物膜，與單用次氯酸鈉顯示出相似的抗菌效果，均比單獨使用CAP有效[13]。

2.2 CAP與其他根管感染相關微生物滅菌后的離體牙根管內培養白色念珠菌—感染根管內最常見的真菌，發現單用CAP殺滅白色念珠菌的效果好過次氯酸鈉和氯己定[14]。在無菌牛牙本質盤上培養來自人牙根管感染的多菌種細菌，證實CAP與氯己定對混合菌種生物膜的殺菌具有協同作用。通過分析CAP在不同深度感染根管中的殺菌效果，發現CAP與氯己定組合使用在整體消毒和根管0～300 μm層內更有效[15]。但實際情況下根管內的感染為多菌種的復雜感染，CAP對根管多菌種生物膜處理效果如何有待進一步研究。

2.3 CAP對根管材料的作用Bisag等[16]用氦等離子體對預備好的離體牙根管處理180秒后，直接使用牙膠尖充填，通過共焦顯微鏡分析發現CAP處理提高了牙膠尖向牙本質小管的擴散和滲透程度。同時CAP處理后環氧樹脂基纖維樁和充填樹脂之間的粘合增加，其原理可能是CAP改變其表面性質[17]，強調了在根尖封閉中避免使用具有細胞毒性的根管封閉劑的可能性，提示CAP輔助根管治療的應用潛力。

3 CAP在牙周病中的應用

牙周和牙髓組織兩個部位的微生物群之間存在相似性,但牙周微生物群變動復雜和多樣化。牙周炎由多種微生物的協同作用和宿主的免疫反應，導致牙周組織進行性破壞[18]。

3.1 CAP與牙周炎感染相關微生物牙周炎生物膜相關的的致病因素包括牙齦卟啉單胞菌、齒狀密螺旋體和連翹革蘭氏菌[18]。CAP對牙齦卟啉單胞菌具有顯著的劑量相關滅活作用，暴露時間越長，細菌抑制區越大。而牙齦卟啉單胞菌生物膜具有多層結構，通過逐層掃描，發現厚度約15 μm，相當于30層牙齦卟啉單胞菌，但CAP可以穿透15 μm的生物膜，有效抑制牙齦卟啉單胞菌[19]。

3.2 CAP在牙周炎中對組織修復作用骨重塑階段是通過骨形成和骨吸收之間的平衡進行管理，其中，成骨細胞在這些過程中發揮重要的關鍵作用并產生多種蛋白質，如堿性磷酸酶、骨鈣素和I型膠原蛋白，它們可以刺激新骨形成。CAP有形成RONS獲得殺菌和促進成骨細胞分化等特性，實驗[20]發現CAP處理后增加大鼠成骨細胞活性并降低破骨細胞活性，同時骨鈣素和堿性磷酸酶抗體的免疫反應性增加。CAP刺激引起的機械負荷和電刺激等物理壓力可能會誘導細胞增殖并促進骨再生。還有實驗[21]分析CAP影響人成骨細胞樣細胞(MG63)基因和蛋白質調節，與未處理的細胞相比，處理組關鍵凋亡標志物p53、凋亡蛋白酶激活因子-1、半胱天冬酶9和半胱天冬酶3的表達顯著下調，CAP對凋亡基因有抑制作用。通過評估應用CAP與牙根平整術對牙周炎患者臨床效果研究，發現CAP作為輔助治療增加了牙齒的臨床附著水平，并有效減少牙周病原體重新定植。以上研究可以認為CAP具有通過炎癥反應調節、成骨細胞分化和減少牙槽骨丟失來加速治療牙周炎的臨床潛力。

4 CAP與種植體周圍炎

種植體周圍炎指伴有支持骨丟失的種植體周圍組織的炎癥反應，是種植體失敗的重要危險因素之一[22]。

4.1 CAP與種植體周圍炎感染相關微生物研究[3,23,24]發現CAP處理不同材質(鈦，氧化鋯)的種植體后，牙齦卟啉單胞菌在其表面的粘附和生長得到抑制，有效減少生物膜，同時對牙齦上皮細胞無明顯細胞毒性，與氯己定、激光等方法對比時顯示了更好的效果。氦氣CAP處理氧化鋯表面后，ROS抑制變異鏈球菌生長，處理的時間依賴性有效性取決于CAP處理后氧化鋯在不同儲存時間下的表面特性和抗菌功效的變化。盡管60秒CAP處理的氧化鋯的抗菌效果隨著時間的推移降低，但14天后處理表面上的細菌比未處理表面上的細菌要少，氧化鋯圓盤仍然具有一定的抑菌能力，通過活性氧染色分析，驗證了其抑菌能力是殘留在氧化鋯表面的ROS對細菌施加氧化應激，導致其死亡[25]。

4.2 CAP與種植體表面改性氧化鋯基臺通過CAP處理后材料表面的親水性增加，表面形貌未變，但鈦表面經過處理后粗糙程度得到提高，促進成骨細胞的粘附、增殖和分化[26]。空氣CAP 對人類牙周細胞、成纖維細胞、成牙骨質細胞和成骨細胞樣細胞具有良性刺激作用，促進其在種植體表面的增殖、黏附，提示CAP治療提供的愈合能力可以增強牙種植體的骨整合，這可能是由于水接觸角減小和表面官能團存在氧，和/或碳污染水平降低[27,28]。通過增強鈦基臺上的種植體周圍軟組織密封，防止口腔環境感染，減少種植失敗，CAP有可能成為種植體周圍炎治療的有效選擇，但關于CAP對種植體周圍炎的作用研究多為體外研究或動物研究，并不完全符合口腔的真實情況。

5 CAP促進口腔傷口愈合

增加活性氧可以促進血管內皮生長因子的釋放和傷口愈合[29]。RONS可以滅活細菌，提高組織中的血氧水平，加速愈合過程。

5.1 CAP通過抗菌促進口腔傷口愈合微生物感染嚴重阻礙或延緩愈合過程，慢性傷口的微生物常具有耐藥性，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，銅綠假單胞菌等。以氯己定作為陽性對照，發現不同氣體(氬氣，氬氣和氧氣混合物)的CAP對銅綠假單胞菌生物膜的治療效果至少與氯己定處理一樣有效，甚至更好，具體取決于氣體、菌種組成和暴露時間[30]。CAP對小鼠感染傷口進行治療時，提高了抗生素的有效性并降低了滅活MRSA生物膜所需的抗生素濃度，同時CAP治療與抗生素相結合可以有效地減少體外和小鼠傷口模型中的生物膜[31]。

6 結語

由于其抗菌性能、促進傷口愈合和生物安全性，CAP在口腔醫學領域具有廣闊的應用前景。目前CAP在口腔醫學的應用仍停留在研究階段以及臨床的初步實驗，實際應用于口腔臨床還需要更深入的研究。作為一項新技術，CAP也存在一些缺點，裝置的成本及其維護是目前很受關注的問題，設備的便攜性也是牙科應用中的一個關注點。這些問題都有待未來的技術革新解決。