日糧添加牡丹籽油改善SD大鼠生育能力的作用研究

霍鵬，曹俊娜，李曼，姚軍*，張順*

（1.桂林醫學院公共衛生學院，廣西 桂林 541199；2.桂林醫學院附屬醫院生殖醫學中心，廣西 桂林 541001）

0 引言

牡丹屬毛茛科芍藥屬多年生灌木植物，油用牡丹種類更是我國獨有的土生土長的木本油料作物，牡丹籽不但產油量高，而且不飽和脂肪酸含量非常豐富，尤其是n-3PUFAs的中的ALA，其含量高達42%。N-3PUFAs是一類人體必須的脂肪酸，主要包括α-亞麻酸（ALA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等，不能由動物自身合成，必須通過外源攝取。N-3PUFAs作用廣泛，可增強青少年視力、促進大腦發育、抗癌、抗炎、減肥等作用[1]，近年來其在生殖健康領域的研究也方興未艾[2]。ALA作為n-3PUFAs家族的重要一種，在雄性的精液質量方面的作用被相繼報道，研究顯示在家兔飼糧中添加富含ALA的日糧可通過改變精子脂質組成改善精子質量[3]；飼喂富含ALA的亞麻籽可以在體內通過碳鏈的延長顯著增加公牛精子DHA 的含量，而且也可以改善精子冷凍和解凍后損傷和質膜的組成成分，提高解凍后精液的質量[4]。此外，飼糧中添加亞麻籽油可改善蛋雞的精液品質、生殖激素及與睪酮合成相關的基因和蛋白表達[5]。但是牡丹籽油作為含ALA最為豐富的油脂資源之一，其在雄性生殖方面的研究尚未見報道，本研究擬通過構建不育大鼠模型，探討牡丹籽油在改善大鼠模型精液質量以及生育力方面的效用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

體重約250-280g的健康SD雄鼠290只（6周齡），SD雌鼠100只，置于溫度(24±1)℃、濕度(60±5)℃，12小時明暗交替環境適應性飼養1周。飼料為SPF級大鼠飼料，墊料為實驗動物專用玉米芯墊料，使用前經高壓蒸汽滅菌。

1.2 主要藥品試劑

白消安、二甲基亞砜（DMSO）等購自Sigma 公司；受精液等購自深圳妙泉儀器設備有限公司，牡丹籽油購自稱山西潞安石圪節智華生物科技有限公司。取200mg白消安粉末溶于20mLDMSO溶液中，完全溶解后，將濃度為10mg/mL的白消安分裝于1.5mL Eppendorf 離心管中，4℃避光保存備用，注射前將該濃儲液用滅菌生理鹽水1：9稀釋（1mg/mL）用于注射。

1.3 方法

1.3.1 不育雄性大鼠模型構建與鑒定

連續10天按4mg/kg的劑量白消安每日注射SD大鼠腹腔，累計注射劑量40 mg/kg，以SD大鼠連續注射第10天為模型第0 d（D0）。于注射后D30采集精液。陰性對照組腹腔注射等量DMSO+生理鹽水。注射結束后取30只大鼠脫臼處死檢查精液質量，首先將睪丸擠入腹腔，腹部皮膚消毒，于腹中線開口，取出附睪，從附睪尾部擠出乳白色精子團，將精子移入1 mL受精液中，二氧化碳培養箱中培養5-10 min，吹打混勻，進行精子計數。取10μL精液，置于精子計數板上，靜置1-2min鐘顯微鏡下觀察；精子畸形檢查參照蘇木精-伊紅染色法。

1.3.2 添加牡丹籽油飼料飼喂

將上述鑒定成功的雄性不育SD大鼠模型隨機分為兩組，對照組(常規日糧)、實驗組(常規日糧+20%牡丹籽油)，喂養12周后進行下一步實驗。

1.3.3 精液質量檢測及生育力檢查

精液檢查同1.3.1；睪丸組織切片步驟為：脫頸椎處死后取睪丸組織，將模型組、牡丹籽油飼喂組以及陰性對照組睪丸取出后切開鞘膜，4%福爾馬林分裝固定。經過脫水、包埋、切片，以蘇木精-伊紅染色制片，顯微鏡觀察各組睪丸組織并攝片。余SD不育大鼠模型及對照組與雌性SD大鼠1:1合籠，觀察雄鼠爬背情況，次日早檢查陰道栓，可見陰道栓者初步判為交配成功，統計產仔情況。

1.4 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用(±s)表示，比較采用t檢驗；計數資料以率(%)表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。。

2 結果

2.1 雄性不育SD大鼠模型的構建與鑒定

白消安注射構建模型D30進行精液檢查，結果如表1所示，與對照組相比，模型組精液在精子密度、精子活力、前向運動精子比例以及精子畸形率上均顯著下降，鑒定結果顯示連續10次注射白消安大鼠腹腔，可成功構建精液質量明顯下降的雄性不育大鼠模型。

表1 白消安注射構建模型D30大鼠的精液情況(±s)

表1 白消安注射構建模型D30大鼠的精液情況(±s)

注：列內具不同上標的值差異有統計學意義a，b，P<0.05.

組別 鼠數 精子密度 精子活力 A+B級精子 精子畸形率模型組 10 7.14±1. 31a 31.45±4. 23a 7.22±1. 46a 97.24±2.56a對照組 10 51.11±2.25b 63.49±2.13 b 32.53±3.42b 85.78±3. 77b

2.2 飼喂牡丹籽油日糧對雄性不育大鼠模型精液質量的影響

（1）不育大鼠模型分別經常規日糧和添加20%比例牡丹籽油的日糧飼喂12周后，精液質量如表2所示，精子密度、精子活力、前向運動精子比例以及正常精子比例，牡丹籽油組均顯著高于常規日糧組，精子形態學檢查如圖1。結果表明牡丹籽油能夠顯著改善不育大鼠模型的精子質量。

圖1 精子形態學檢查

表2 常規日糧和添加牡丹籽油日糧飼喂后精子質量情況(±s)

表2 常規日糧和添加牡丹籽油日糧飼喂后精子質量情況(±s)

注：列內具不同上標的值差異有統計學意義a，b，P<0.05.

組別 鼠數 精子密度 精子活力 A+B級精子 精子畸形率模型組 25 13.16±2. 38a 36.21±2. 21a 11.28±1. 47a 94.24±2.56a牡丹籽油組 25 34.92±2.25b 51.42±3.43 b 27.51±3.65b 87.72±3. 43b

（2）飼喂牡丹籽油日糧對雄性不育大鼠模型睪丸組織形態的影響

不育模型組整個睪丸組織嚴重萎縮，極度退化變性，精曲小管萎縮變細疏松，管腔內各級生精細胞呈明顯的空泡化，基底膜側精原細胞偶見，精曲小管內未見精子；間質組織發生退化，細胞形態不完整，排列紊亂，總體表現基本喪失生精能力（圖2）。飼喂含有牡丹籽油的日糧后，可見大部分的精曲小管恢復2-4層生精上皮細胞，基底膜側可見散在精原細胞，整體表現仍為精子生成能力低下（圖3），組織形態學表現與附睪精子質量檢測結果一致，但是與對照組相比，生精能力僅為部分恢復（圖4）。

圖2 模型組睪丸形態學

圖3 對照組睪丸形態學

（3）飼喂牡丹籽油日糧對雄性不育大鼠模型對生育力的影響

將每只不育模型SD雄鼠單獨飼養，按1：1的比例與雌鼠合籠，觀察雄鼠爬背情況，次日早檢查陰道栓，見陰道栓者初步判為交配成功；產仔時，統計產仔率。結果如表5所示，與常規日糧組相比，牡丹籽油組的雄鼠的爬背發生率、見栓率以及產仔率上均顯著升高，而與未做任何處理的陰性對照組相比，仍顯著低于陰性對照組，以上結果表明牡丹籽油能在一定程度上改善雄性不育大鼠的生育力。

3 討論

3.1 牡丹籽油對雄性不育大鼠精液質量的改善

近年來，由于受生育年齡推遲、環境改變、壓力增大、生育意愿低等原因，人口出生比例嚴重下降已經是一個不可回避的社會問題，統計顯示約有15%左右的育齡期夫婦存在著生育障礙，其中男性因素引起的比例占約40%，最新的男性精液質量調查報告顯示，男性精子質量仍然有下降的趨勢[6]，雖然男性精液質量下降可以通過輔助生殖手段解決生育需求，但是科學技術總是存在兩面性，輔助生殖技術畢竟還是一個未經過歷史長期檢驗的技術，在子代的表觀遺傳、畸形率、并發癥的長期觀測上還缺乏足夠相應的數據支持[7]，因此，自然生育仍然是獲得子代的首選方式。

許多研究都表明n-3多不飽和脂肪酸對雄性動物的精液有著顯著的提高作用，主要聚焦在DHA和EPA等長鏈n-3PUFAs的探討上，因為他們不僅是影響精子活力的精子質膜的重要組成部分，而且有較強的抗氧化能力，因此在日糧中添加富含長鏈n-3PUFAs日糧中，可顯著改善豬、牛等動物的精子活力、頂體完整性、精液量；降低畸形精子率和頂體異常比例；提高解凍后精液品質，甚至于調控相關基因誘導精子的發生[8,9]。但是短鏈n-3PUFAs對精液質量的探討較少，目前主要聚焦在亞麻籽及亞麻籽油對雄性生育能力的影響，研究顯示富含ALA的亞麻籽及亞麻籽油也能能顯著改善家畜的繁殖性能。牡丹籽油同樣作為含有ALA最為豐富的植物油脂之一，進行雄性生育力影響的實驗研究亦有著獨特的優勢，在本研究中結果顯示牡丹籽油確實提高了大鼠模型的精液質量，包括提升了精液密度，增強了精子活力，降低了畸形率，以上結果表明牡丹籽油對精子的發生和成熟有明顯的促進作用，這和同樣作為ALA主要來源的亞麻籽油在動物上的研究結果相似。因此牡丹籽油作為雄性動物的n-3PUFAs的補充劑對于提高生育力及繁殖性能也有著同等重要的應用潛力。

3.2 牡丹籽油對雄性不育大鼠模型生育力的改善

日糧中添加n-3PUFA 可提高多種雄性動物的繁殖力，但是上述研究主要采用以富含長鏈n-3多不飽和脂肪酸的魚油為主要載體，而對于短鏈n-3多不飽和脂肪酸與雄性生育力的相關性研究不多見。通過人體內的同位素追蹤技術，發現攝入的ALA有高達21%的轉化成EPA，有9%轉化成了DHA，轉化效率較為可觀[10]，因此飼喂富含ALA的日糧對促進雄性動物的生育力改善也有著充分的理論依據。文獻報道，在日糧添加了亞麻籽油的雄性動物中發現，可以顯著提高大鼠的血清睪酮水平，睪酮對維持睪丸生精功能起著至關重要的作用[11]，這一點與本研究中牡丹籽油促進生精小管的有著相同的結局，此外隨著日糧中亞麻籽油的比例增高，其體內的前列腺素也在增加，有研究表明前列腺素可直接刺激睪丸間質細胞分泌睪酮，進一步增加睪丸體積、精子數量以及提高精子的活動能力。

本研究結果不僅從精液層面驗證了牡丹籽油對精液質量的改善作用，而且在形態組織學上進行了驗證，通過睪丸組織的免疫組化結果表明，牡丹籽油顯著改善了不育大鼠的生精功能。但是，雖然在牡丹籽油的毒理學檢測中，結果顯示牡丹籽油對精子質量沒有促進作用[12]，但是我們認為因其實驗設計的劑量和飼喂時間的區別，從而導致與本研究結果存在一定的出入，但是不存在相駁的結論，在另一項牡丹籽油對環磷酰胺致小鼠遺傳毒性和肝損傷的保護作用研究中，結果顯示日糧添加牡丹籽油確實提高了精液的質量[13]。通過生育力檢測發現，牡丹籽油飼喂的不育SD大鼠模型的生育力得到了顯著的恢復，結果同文獻報道的飼喂長鏈n-3PUFAs的研究結果相一致，而且與亞麻籽油的結果相一致。

綜上所述，通過成功構建雄性不育大鼠模型，進行添加牡丹籽油的日糧飼喂，經檢測發現牡丹籽油不但能提高雄性不育大鼠的精液質量，而且能夠部分恢復其生育功能，結果表明牡丹籽油確能有改善雄性生育能力的作用。