人血清microRNAs作為腦卒中后認知功能障礙生物標志物的研究

周凡萍，黃墩兵，黃賽娥

（1.福建生物工程職業技術學院，福建 福州 350000；2.浙江醫院，浙江 杭州 310013；3. 福建中醫藥大學附屬康復醫院，福建 福州 350000）

0 引言

腦卒中后認知功能障礙（post-stroke cognitive impairment,PSCI）是一種常見并且嚴重的腦卒中后遺癥，常導致患者注意功能、計算能力和執行功能等腦高級功能障礙[1-3]，影響患者康復進程和效果。當前康復鄰域評定患者認知功能的方式停留在各種量表的使用，但是對于意識不清、言語障礙、情感障礙、雙側手運動不能的患者，量表有其局限性。臨床上目前也沒辦法完全克服量表多次使用后失效的問題。所以，如果能夠對患者血清進行生物標志物的檢測，快速、簡單、無創地利用患者血清生物標志物對對患者進行認知功能的評估，對PSCI的早期診斷、早期治療意義重大，也有利于PSCI的臨床管理。miRNAs是人體內源性非編碼單鏈小分子RNA，長度約22個核苷酸。miRNAs在血液中的表達量不是穩定不變的，會隨著機體生理病理的改變而改變[4]。本團隊前期工作中已對單個miRNAs與PSCI的關系進行了研究，發現血清miR-132的表達量與PSCI密切相關，患者血清miR-132的高表達預示著PSCI的程度越嚴重[5]。本次實驗意在進一步通過Solexa高通量測序獲得PSCI患者血清miRNAs的表達譜，從中篩選出差異表達的miRNAs進行驗證，并做相關分析，尋找臨床診斷PSCI的潛在新分子標志物。

1 資料與方法

1.1 研究設計及對象來源

本次研究方法屬于病例-對照，所有受試人員都招募于福建省康復醫院，對所有就診人員進行公開招募，時間跨度為2017年1月至2019年9月。按照表1-1、表1-2、表1-3中納排條件將受試人員分為三個組，分別為PSCI組、PSCN組、AMC組。三組間年齡、性別、受教育年限、基礎疾病相匹配，另外PSCI組、PSCN組間卒中類型、病灶、病程、腦卒中損傷程度相匹配。

1.2 研究對象納排標準

基于本項研究的不同之處，本團隊充分研究了將既往有關腦卒中后認知功能障礙的隨機對照研究的納排條件之后，決定將《Trials》雜志里的一項有關PSCI的隨機對照研究中的納排要求進行了刪減，確定了下表納排標準，詳見表1、2、3。

表1 腦卒中后認知功能障礙組（PSCI）

表2 腦卒中后認知功能正常組（PSCN）

表3 年齡匹配對照組（AMC）

1.3 標本采集采取受試人員空腹血5mL，隨即在低速離心機中離心，速度設置為3000 rpm，時間為5min，經初步離心后取最上層的血清，轉移至對應編號的1.5mL無Rnase EP管中。然后將EP管放入低溫高速離心機中離心5min，速度為于12000 rpm，溫度為4 ℃，完全清除標本中殘余的血細胞。將標本取出按序號分組放入凍存盒，凍存盒上標注組名，置于-80℃冰箱保存，用于下一步實驗。

1.4 Solexa測序

從三組血清標本中各挑選5個樣本，三組間性別、年齡、文化程度、基礎疾病相匹配，另外PSCI組、PSCN組間腦卒中類型、發病部位、病程、腦卒中損傷程度相匹配。將標本埋于干冰送往廣州市基迪奧生物有限公司進行高通量的Solexa測序。

1.5 血清RNA提取和逆轉錄

本研究采用miRNA純化試劑盒（北京艾德萊公司，RN4601），嚴格遵照配套使用說明書進行操做分離提取miRNA。分離提取后的樣本都需行濃度和純度的檢測，檢測使用的是德國Thermo公司NanoDrop 2000c分光光度計。通過檢驗之后篩選出A260/A280比值在1.80-2.12之間的、濃度在20 ng/μL以上的miRNAs樣品進行下一步實驗。然后使用南京諾唯贊生物科技有限公司的試劑盒（MQ101-02）進行逆轉錄實驗，選擇miR-16作為內參進行校正[7]，其序列為：TAG CAG CAC GTA AAT ATT GGC GT。

1.6 RT-qPCR檢測

使用南京諾唯贊生物科技有限公司提供的ChamQTMSYBR qPCR Master Mix (MR101-02)試劑盒進行miRNAs檢測，嚴格按照說明書步驟操作。得到的miRNAs的Ct值與miR-16的Ct值相減得到差值-ΔCt，2-ΔCt則表示miRNAs相對表達量，然后經由對數轉換，即log102-ΔCt，最終得到正常化的Ct值。

1.7 統計分析

本研究通過IBM SPSS 20.0對數據進行統計。計量資料以均數±標準差表示。三組組間比較，符合正態分布使用單因素方差分析，不符合則使用Kruskal-Wallis H（K）檢驗。兩組組間比較，符合正態分布使用獨立樣本t檢驗，不符合則使用Mann-Whitney U檢驗。若數據符合正態分布使用Pearson相關進行分析，不符合則使用Spearman相關分析。最后，通過ROC曲線和曲線下面積（area under curve,AUC）來評估miRNAs的診斷能力。

2 結果

2.1 各組一般資料的分布三組受試者性別、年齡、受教育水平等一般資料差異均無統計學意義。見表4。

表4 三組間一般資料的分布（±s, n）

表4 三組間一般資料的分布（±s, n）

特征 PSCI(n=60) PSCN(n=60) AMC(n=60) P 年齡（歲） 61.08±10.3160.65±9.9658.97±9.100.295 教育程度（年） 7.50±3.038.10±2.777.45±2.770.429 MoCA評分 9.32±6.1526.75±0.8927.45±1.25 ＜0.001 性別（男/女） 42/1839/2131/290.101 腦梗死/腦出血 33/2723/37 - 0.067 左側/右側/雙側 27/29/422/36/2 - 0.381 高血壓史 28/3223/3724/360.619 糖尿病史 20/4027/3321/390.362 高血脂癥史 26/3435/2532/280.246 心臟病史 17/4316/4420/400.706 吸煙史 19/4119/4115/450.652

2.2 Solexa測序結果

根據此前研究，我們將log2_FC(PSCI/PSCN)≥3和P value＜0.05的miRNAs作為顯著差異表達的miRNAs。本研究中，我們共篩選出10個差異表達miRNAs。見表5。

表5 顯著差異表達miRNAs

2.3 第二階段RT-qPCR驗證

小樣本驗證階段發現PSCI組與PSCN組相比 較，miR-20a-5p,miR-20b-5p,miR-191-5p, miR-93-5p,miR-5991-y和miR-30d-5p顯著上調。miR-193b-5p,miR-134,miR-132-5p和 miR-214-y顯著下調。見圖2-1a。在大樣本驗證階段，我們發現miR-5991-y, miR-30d-5p,miR-132-5p和miR-214-y表達量無顯著性差異，其余6個miNRAs表達情況與小樣本量階段一致。其中，miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-191-5p和miR-93-5p顯著上調，miR-193b-5p和miR-134顯著下調。見圖1。

圖1 a 小樣本量階段PSCI組與PSCN組miRNAs表達量。b大樣本量階段PSCI組與PSCN組miRNAs表達量(*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001)

此外，我們檢測60例AMC患者血清中miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-191-5p，miR-93-5p，miR-193b-5p和miR-134表達量。結果顯示，miR-20a-5p，miR-20b-5p，miR-191-5p和miR-93-5p在PSCN和AMC患者之間存在顯著差異，miR-20a-5p，miR-93-5p，miR-193b-5p和miR-134在PSCI和AMC患者中存在顯著差異，相較于AMC患者，miR-20a-5p和miR-93-5p在PSCI中顯著上調，而miR-193b-5p和miR-134顯著下調。見圖2。

圖2 PSCI、PSCN和AMC患者中miRNAs相對表達量

2.4 ROC分析

采用ROC曲線分析6種血清miRNA對PSCI的 診 斷 價 值，6種 血 清miRNA（miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-191-5p，miR-93-5p，miR-193b-5p和miR-134）的ROC曲線下面積分別為0.862(95%CI:0.806,0.918)、0.726(95%CI:0.652,0.799)、0.781(95%CI:0.710,0.852)、0.897(95%CI:0.852,0.943)、0.762(95%CI:0.830,0.694)、0.877(95%CI:0.926,0.829)、0.998(95%CI:0.995,1)。ROC曲線分析結果顯示miR-93-5p診斷效能最高，miR-134次之。

我們進一步采用多元Logistic回歸方法計算6個血清miRNAs組合診斷PSCI的ROC曲線，構建了回歸方程：Logit(p)=0.204-19.042×(miR-20a-5p)-7.669×(miR-20b-5p)-18.586×(miR-191-5p)-31.898×(miR-93-5p)+10.181×(miR-193b-5p)+21.03×(miR-134)。ROC曲線分析6個血清miRNAs組合診斷PSCI的靈敏度100%，特異度99.2%，比單個血清miRNAs診斷PSCI的敏感度和特異性高，AUC為0.998，具有良好的診斷效能。見表6和圖3。

圖3 6個miRNAs的ROC曲線圖

表6 6個miRNAs的ROC曲線分析

3 討論

我國腦卒中發病率逐年升高，一半以上的腦卒中患者出現PSCI[8]。PSCI患者無法與周圍人群進行正常交流，積極主動性差。此外，PSCI患者因交流的障礙不能聽從指令配合康復訓練，康復進程慢，效果差，日常生活嚴重依賴。認知障礙的評估常用評定量表[9]，存在局限性。研究表明，miRNAs能穩定存在血清中[10]，且血清提取方便快捷，成本低廉。因此，血清miRNAs有望作為PSCI的預測、診斷及評估的方便快捷指標。

本研究結果顯示6個miRNAs（miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-191-5p，miR-93-5p，miR-193b-5p和miR-134）的相對表達量在PSCI、PSCN和AMC患者之間存在顯著性差異（P＜0.01）。上述6個miRNAs在多個研究報道中提及，闡明了miRNAs與突觸可塑性、認知相關疾病、記憶等關系。Kart Varendi等[11]的研究表明腦源性神經營養因子（BDNF）的表達與血清miR-191水平相關，實驗發現低濃度的miR-191會促進BDNF的表達，miR-191的高表達反而不利于BDNF的信使RNA的翻譯，而多項研究已經證實BDNF有助于神經元的生長，在突觸可塑性方面有著積極作用[12-13]。Myrrhe van Spronsen等[14]對各個發育時期的海馬神經元微小RNAs表達譜進行研究，他們研究數據顯示miR-191與海馬NMDA受體依賴的可塑性相關。Hui Dong等[15]的研究中同樣利用Solexa技術獲得了阿爾茨海默病（AD）患者與非癡呆人群血清微小RNAs的表達譜，對比表達譜發現差異表達的微小RNAs，發現了miR-191、miR-93在兩組人群中存在顯著統計學意義。Subodh Kumar等[16]亦研究了miRNAs與AD的關系，其中就包括miR-191-5p，所有相關微小RNA中，miR-191-5p曲線下面積最大，相關性最強。亦有研究表明，miR-20a-5p在AD患者DE 血清中明顯上調[17]。Pete Heinzelman等[18]及Liu等[19]的研究不僅表明miR-193b減少與AD的發病機制有關，對miR-193b的調節還有望成為治療AD的一種手段。胡雅坤等[20]的研究發現miR-134的存在可下調BDNF 表達，從而促進海馬神經細胞的凋亡。

進一步行ROC曲線獨立分析結果提示單一miRNA對診斷PSCI有一定的指導意義。我們采用多元邏輯回歸方法計算6個miRNAs組合的ROC曲線。Logistic回歸模型方法計算6個血清miRNAs組合的AUC為0.998，說明6個miRNAs具有較高的診斷PSCI的效能。這些結果說明6個miRNAs組合物作為診斷PSCI的生物標志物存在潛在價值。