長鏈非編碼RNA 在大面積燒傷后瘢痕增生患者血清中的差異性表達(dá)

徐樹岑，周萍，王飛

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷科，安徽 合肥 230022)

0 引言

大面積燒傷是生活中常見的重度損傷之一，大部分大面積燒傷患者愈合后會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的瘢痕增生。瘢痕是皮膚損傷后，經(jīng)過各種細(xì)胞的增生爬行從而愈合后遺留的與正常組織有明顯區(qū)別的組織。在創(chuàng)面產(chǎn)生后，創(chuàng)面四周的成纖維細(xì)胞向創(chuàng)口中央爬行、增殖并分泌富含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)從而填補(bǔ)創(chuàng)面的組織缺口。瘢痕愈合主要包括正常瘢痕愈合(也稱為生理性瘢痕愈合)及異常瘢痕愈合(又稱病理性瘢痕愈合)[1]。LncRNA 是一種長度大于200 個(gè)核苷酸的不編碼的RNA，但是和編碼的RNA 一樣，LncRNA 對于染色體、基因簇乃至單個(gè)基因的水平發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，是基因調(diào)控網(wǎng)的組成部分。本研究采用新興的LncRNA 基因芯片技術(shù)，探究在燒傷瘢痕的形成過程中LncRNA 所起到的作用，同時(shí)對比燒傷后瘢痕增生患者與正常人血清中LncRNA 表達(dá)水平的差異，以期為治療燒傷瘢痕的未來提供了重要的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 一般資料

1.1.1 患者入選標(biāo)準(zhǔn)

入組標(biāo)準(zhǔn)：選取燒傷后24 小時(shí)內(nèi)入院，年齡18-40 歲，致傷原因?yàn)闊崃齻瑹齻娣e大于或等于30%TBSA，深度為深Ⅱ度-Ⅲ度。排除標(biāo)準(zhǔn)：電燒傷，電弧燒傷，合并有心、肺、腦、肝、腎或既往有血糖代謝異常及免疫功能異常病史等其他系統(tǒng)基礎(chǔ)疾病，有免疫藥物治療史。入組病例均符合人體試驗(yàn)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并得到倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，入組病例在入組前知情同意并簽署知情同意書。

1.1.2 標(biāo)本收集

選擇2019 年在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院診斷為燒傷大于體表面積30%、燒傷深度為深Ⅱ度-Ⅲ度的5 例患者為觀察組，其中男性3 人、女性2 人，取樣時(shí)間為創(chuàng)面愈合后3 月。選擇5 例正常人為對照組，其中男性3 人、女性2 人，無燒燙傷史、體檢結(jié)果為健康。

1.2 研究方法

1.2.1 血清制備

對照組于體檢時(shí)，大面積燒傷后瘢痕增生患者在傷后治愈3 月后復(fù)查時(shí)，清晨空腹抽取靜脈血液樣本5mL，4℃，離心管半徑10cm，靜置1h，3000r離心10min，分離血清置于離心管中待測，-80℃保存。

1.2.2 芯片的選擇

Arraystar LncRNA 芯片對權(quán)威數(shù)據(jù)庫(如RefSeq、UCSC、RNAdb、NRED、LncRNAdb 等)和高水平文章中的LncRNA 進(jìn)行了嚴(yán)格的篩選，并對符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的LncRNA 進(jìn)行了全面的收集。

1.2.3 探針的設(shè)計(jì)

Arraystar LncRNA 芯片針對不同轉(zhuǎn)錄本設(shè)計(jì)了外顯子特異性探針或是剪切連接位點(diǎn)特異性探針，能夠?qū)崿F(xiàn)對不同轉(zhuǎn)錄本的準(zhǔn)確、特異性的檢測，這對LncRNA 的功能分析極為關(guān)鍵。此外，Arraystar LncRNA 芯片的優(yōu)點(diǎn)在于探針與LncRNA的對應(yīng)關(guān)系非常簡單，采用“一個(gè)LncRNA 對應(yīng)一根探針”的策略。

1.2.4 RNA 的標(biāo)記、提取、雜交

于血清中加入TRIZOL(美國Invitrogen 公司)試劑，提取總RNA.應(yīng)用NanoDrop ND1000 的紫外分光光度計(jì)評估所提取的RNA 量及質(zhì)量，標(biāo)準(zhǔn)的變性凝膠電泳檢測RNA 的完整性。采用Arraystar人類LncRNAV3.0 芯片(Arraystar 公司，美國) 檢測樣本中LncRNAs 的表達(dá)。根據(jù)Agilent One-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行樣品標(biāo)記和基因芯片雜交：(1) 從總RNA 中移除rRNA，得到mRNA；(2) 反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，轉(zhuǎn)錄成帶熒光的cRNA；(3) 根據(jù)RNeasyminiKit 總RNA 試劑盒檢測純化標(biāo)記的cRNAs，應(yīng)用NanoDropND-1000 檢測其濃度和活性；(4)芯片雜交；(5)洗滌、固定并掃描雜交芯片。

1.2.5 分析方法

通過Agilent Feature Extraction 軟件獲得不同組別的芯片圖，并獲得原始數(shù)據(jù)，進(jìn)一步使用Gene Spring GX V12.1 軟件對所獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行Quantile 標(biāo)準(zhǔn)化及數(shù)據(jù)處理.樣品間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)LncRNA 或mRNA 通過P-value 進(jìn)行FDR 篩選，參選標(biāo)準(zhǔn)：組間基因表達(dá)差異倍數(shù)2倍以上(P＜0.05，中國上海康成生物公司完成上述數(shù)據(jù)分析)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，比較用配對t檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較用Dunnett-t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Spearman 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA 的差異性表達(dá)

通過LncRNA 芯片分析出燒傷后瘢痕增生組血清中和正常對照組血清中的LncRNA 表達(dá)量，將兩者的lncRNA 表達(dá)量相比較，篩選出其中變化倍數(shù)(fold change)超過2 倍并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)的部分LncRNA，這部分lncRNA 被認(rèn)為是差異表達(dá)的LncRNA。差異倍數(shù)達(dá)2 倍以上的LncRNA 共有2735 條；其中表達(dá)上調(diào)的有1626條；表達(dá)下調(diào)的有1109 條。因數(shù)據(jù)量太大，排序后挑選部分表達(dá)倍數(shù)更高的LncRNA 進(jìn)一步研究。

2.2 變化倍數(shù)達(dá)5 倍的LncRNA

升高5 倍以上的有116 條，降低5 倍以上的有514 條(見表1)。結(jié)果表明燒傷后瘢痕增生患者和正常人的血清比較LncRNA 的表達(dá)譜差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 大面積燒傷患者與正常人血清對比升高倍數(shù)＞10 倍的LncRNA(Top10)

2.3 變化倍數(shù)達(dá)10 倍的LncRNA

升高10 倍以上的有12 條，降低10 倍以上的有246 條(見表2)。

表2 大面積燒傷患者與正常人血清對比降低倍數(shù)＞10 倍的LncRNA(Top10)

2.4 分析結(jié)果及進(jìn)一步研究有重點(diǎn)意義的LncRNA

用火山散點(diǎn)圖(volcano plots) 的方法分析變化倍數(shù)超過2 倍，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)的LncRNA，觀察目標(biāo)LncRNA 的分布和統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)，在差異表達(dá)的lncRNA 中在數(shù)據(jù)庫(GENCODE、RefSeq)找到了與其相關(guān)的蛋白為FGF13、SMAD1、FIGF、MMP25(見表3)。

表3 部分差異表達(dá)的LncRNA 相關(guān)的信息

3 討論

瘢痕常常繼發(fā)于皮膚組織的各種創(chuàng)傷與破損后，影響瘢痕形成的因素有許多，宏觀上與皮膚受傷深度、患者年齡等有關(guān)，微觀上與生長因子表達(dá)與調(diào)節(jié)、膠原蛋白的異常、遺傳、免疫等機(jī)制有關(guān)[2]。瘢痕的形成過程主要與成纖維細(xì)胞的過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的大量沉積有關(guān)[3]。同時(shí)在燒傷后皮膚的炎癥期、恢復(fù)期、重建期中，炎癥反應(yīng)也是決定瘢痕形成的重要因素。產(chǎn)生的瘢痕無論面積大小、發(fā)生在何種位置，都會(huì)對患者產(chǎn)生不良的身心影響、生活質(zhì)量下降，甚至正常功能的喪失[4-7]。目前國內(nèi)臨床上常見的治療方法有壓迫治療、二氧化碳點(diǎn)陣激光、糖皮質(zhì)激素、洋蔥提取物、硅酮制劑、A 型肉毒素(BTA)瘢痕內(nèi)注射、抗腫瘤藥物注射、自體脂肪移植填充、手術(shù)切除和放射性治療等，某些近年來新興的治療方法如免疫療法等也備受關(guān)注[8-14]。近年來基因療法正成為更新興、有效的治療手段。LncRNA 對細(xì)胞的分化、機(jī)體的生長發(fā)育、創(chuàng)傷的愈合都有重要影響[15]，且具有比編碼RNA 更強(qiáng)的組織和細(xì)胞特異性[16]。宏觀上，機(jī)體的穩(wěn)定性與LncRNA 的水平密切相關(guān)；微觀上，基因的相互調(diào)節(jié)與穩(wěn)態(tài)也受到LncRNA 的調(diào)控[17]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明燒傷后瘢痕增生患者和正常人的血清比較LncRNA 的表達(dá)譜差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在燒傷后瘢痕增生患者與正常人血清中部分LncRNA 的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(差異倍數(shù)≥2，P＜0.05)，有些LncRNA 表達(dá)明顯上調(diào)，有些LncRNA 表達(dá)明顯下調(diào)。從而可以說明這些LncRNA 與燒傷后瘢痕增生存在相關(guān)關(guān)系，推斷出這些差異性表達(dá)的LncRNA 在不同程度上影響了燒傷后瘢痕增生的形成過程。而在本研究中顯示的與其相關(guān)的蛋白FGF13、SMAD1、FIGF、MMP25等，也在相關(guān)文獻(xiàn)中找到其作用及影響。既往研究表明，F(xiàn)GF13(fibroblast growth factor) 在幾種類型的癌癥中過表達(dá)，如黑色素瘤和胰腺內(nèi)分泌腫瘤[18-19]。FGF13 與lncRNA LINC00963下調(diào)調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)[20]。SMAD1 基因是SMAD 家族的成員之一，SMAD 蛋白家族是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，直接參與轉(zhuǎn)化生長因子β(transforminggrowth factor-β，TGF-β)超家族成員TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白、活化素等多個(gè)成員的信號傳導(dǎo)；同時(shí)也參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡，從而維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。SMAD1 作為 TGF-β/ SMADs信號通路下游重要的轉(zhuǎn)錄因子，分布于不同組織中，并介導(dǎo)多種類型的生理過程[21]，SMAD1 也被報(bào)道參與LncRNA-MEG3 通過調(diào)控miR-26a/Smad1軸調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化血管平滑肌細(xì)胞增殖/凋亡平衡[22]。MMP16 是與纖維化直接相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)基因家族的一部分[23]。先前的研究表明，Ⅰ，Ⅳ型膠原蛋白在傷口愈合中發(fā)揮重要作用，I 型膠原溶解是由分泌的以及在成纖維細(xì)胞介導(dǎo)的基質(zhì)重塑過程中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)基因家族的膜錨固定成員介導(dǎo)的[24]。

現(xiàn)如今，創(chuàng)面的愈合已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止是治療的終點(diǎn)，而如何在創(chuàng)面愈合后減少瘢痕的增生并保持功能的正常及外表的美觀，是燒傷治療的必經(jīng)之路。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出的部分LncRNA 表達(dá)出的巨大差異，通過相關(guān)蛋白質(zhì)的定位及繼續(xù)研究相關(guān)的通路機(jī)制，可以期待進(jìn)一步研究LncRNA 對于影響瘢痕形成的作用機(jī)制將有助于在可預(yù)期的未來中更好的預(yù)防燒傷后患者瘢痕增生的發(fā)生，為瘢痕的基因治療提供新思路。