針灸拮抗CTX荷瘤小鼠骨髓細胞中jag1、Notch2和numb1/2 mRNA的作用機制研究

莊語,于冬冬,*,程相琨,范世東,劉玉璐,馬田田,王永欣,王文哲

(1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046；2.河南中醫藥大學第三附屬醫院，河南 鄭州 450008；3.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450001)

環磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)作為常用廣譜類抗腫瘤藥[1]，其治療惡性腫瘤的同時也會導致許多毒副作用，特別是抑制骨髓造血功效，造成白細胞下降，機體自身免疫下降[2-3]。前期課題組的研究結果證實，針灸能夠通過調節骨髓細胞DNA修繕，有效抑制過度激活的Notch信號通路，促使白細胞歸巢，修復造血微環境的損害等方面來改善化療造成的骨髓抑制[4-7]，本課題采用RT-PCR技術在前期篩選出的Notch傳導路徑上關鍵基因jag1、Notch2、numb1、numb2為切入點[8]。觀察針灸對其mRNA的干預，探究討論其改善CTX化療所引發骨髓抑制的機理。選取荷瘤模型小鼠，旨在使荷瘤小鼠體質無限貼合腫瘤病患，為臨床上針灸診治惡性腫瘤化療所致骨髓抑制提供相關有效研究根據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級KM種雄性健康小鼠，采購于鄭州大學動物研究中心，批號：SCXK(豫)2010-0002，體質量(18.0±2.0)g。在河南中醫藥大學動物研究所飼養，溫度：20～25 ℃，相對濕度：50%～70%，3 d后植瘤。

1.2 試劑

環磷酰胺(山西普德，批號：04120501)；氯化鈉溶液(250 mL/瓶，山東魯抗辰欣藥業，批號：120412107)；Trizol：invitrogen (貨號：15596-026)；DEPC處理水(貨號：BYL40387)；氯仿、異丙醇 HPLC級；無水乙醇 AR級；SYBRGreen PCR試劑盒(Thermo貨號：F-415X)L，逆轉錄試劑盒(Thermo貨號：#K1622)。

1.3 儀器

實驗用艾灸條(規格:0.4 cm×25 cm，河南南陽臥龍艾絨廠)；美容毫針(規格:0.19 cm×10 mm，蘇州醫療用品有限公司)；光學顯微鏡；一次性微量采血管；白細胞計數板；恒溫器(型號：K10CD)；旋渦振蕩器(型號：XW-80A)；冷藏冰箱(型號：BDC-280e)；離心機(Sigma)；Real-time檢測儀(7500Sequence Detection System，型號：ABI-7500型，美國)等。

1.4 模型制作方法

依據課題組的預建模方法進行[9]。將腫瘤細胞5×106/0.2 mL植入40只小鼠的左腋窩中，7 d后，共選擇32只WBC計數值正常且符合試驗標準的荷瘤小鼠,(22±2)g、瘤塊半徑0.4 cm左右,分成4組，每組8只，染色編號。荷瘤空白對照組腹腔注入等量0.9%Nacl溶液，其余3組均一次性腹腔注射同等濃度150 mg/kg的CTX。遵照CTX藥代動力學過程，停藥4 h后造模順利達成[10]。

1.5 干預方法

針療干預組于造模成功24 h后實施針刺干預，選穴定位參照《實驗針灸學》[11]選“大椎”以及雙側“膈俞”“腎俞”“足三里”，直刺3 mm，留針6 min，1次/d，共5 d。灸療干預組于造模成功24 h后實施艾灸干預，選穴同上，將細艾條距局部穴位皮膚2 cm處懸灸3 min，兩穴為1組，共懸灸6 min，1次/d，共5 d。荷瘤空白組和CTX模型組給予同干預組相同抓取及固定方法，不進行任何干預。

1.6 取材方法

各組小鼠于植瘤7 d后施尾部靜脈采血，根據編號依次加入390 μL 3%冰乙酸稀釋液，連續6 d，用于白細胞計數測量；治療結束后，禁食不禁水1 d，第6天開始對所需標本解剖取材。各組小鼠依次置于消毒實驗臺上，進行頸椎脫臼處理，操作者在干冰上取小鼠同側的肱骨和股骨，剔凈骨頭附著組織，置于裝有0.9% Nacl溶液燒杯中清洗干凈后，于-80 ℃低溫冰箱中快速儲存，用于熒光定量PCR。

1.7 觀察指標及檢測方法

小鼠一般情況觀察：對比觀察每組小鼠在整個實驗過程的體質量、飲水進食、精神狀態、毛發色澤、二便和活動等情況。

外周血白細胞計數：取標本血樣，充分搖勻后用玻璃棒依次將溶解均勻的血液稀釋液從蓋玻片旁滴入白細胞計數板，在光學顯微鏡下進行觀察并記錄白細胞計數板上4個象限的白細胞數，根據公式計算最終數據。

熒光定量PCR法檢測肱、股骨組織jag1、Notch2、numb1、numb2 mRNA 的表達,取-80 ℃保存的標本，用Trizol提取總RNA，將所提取RNA逆轉錄成cDNA，將制備好的cDNA進行PCR擴增，反應條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，40個循環。以GAPDH為內參，用2-△△Ct法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 各組小鼠一般狀況比較

荷瘤空白組小鼠體質量無明顯改變，飲水進食量正常，精神良好，毛色鮮亮有澤、觸摸順滑，二便正常及活動正常；CTX模型組小鼠體質量下降，飲水進食量減少，精神萎靡，毛發少光澤且部分小鼠伴有毛發脫落，大便溏，小便量減少，活動力下降且伴有扎堆表現；與CTX模型組比，其余兩組小鼠上述狀態均顯著緩解。

2.2 各組小鼠外周血白細胞計數比較

與荷瘤空白組比，各組小鼠白細胞計數從注射CTX后第1天至第3天持續下降，且在第3天降至最低(P<0.05)；與CTX模型組比，從第4天開始，針療干預組和灸療干預組白細胞回升速度明顯高于CTX模型組；與針療干預組比，灸療干預組白細胞水平差異無統計學意義，見表2。

表2 各組小鼠外周血白細胞計數的變化

2.3 各組小鼠肱、股骨組織jag1、notch2、numb1、numb2 mRNA表達比較

與荷瘤空白組比較，CTX模型組小鼠肱、股骨組織jag1、notch2 mRNA表達均升高，numb1 mRNA表達降低，但差異無統計學意義，numb2 mRNA表達降低(P<0.05)；與CTX模型組比較，針療干預組與灸療干預組小鼠肱、股骨組織jag1、notch2 mRNA表達均降低，針療干預組numb1 mRNA表達降低，灸療干預組numb1 mRNA表達升高，結果差異無統計學意義，灸療干預組numb2 mRNA表達升高(P<0.05)；與針療干預組比，灸療干預組小鼠肱、股骨組織jag1、notch2、numb1、numb2 mRNA表達差異無統計學意義，見表3。

表3 各組小鼠肱、股骨組織jag1、notch2、numb1、numb2 mRNA表達比較

3 討論

化療作為全世界公認的治療惡性腫瘤的關鍵常規措施，然骨髓抑制則是惡性腫瘤化療后臨床上多見的毒副反應，其中以外周血白細胞生成障礙且降低為主[12]。臨床多見倦態乏力，唇白神疲，納差汗多，氣短健忘，舌淡脈弱等相關虛損癥狀，中醫多稱之為“虛勞”“血虛”等。《傷寒論》認為“虛勞”治宜溫養脾腎，扶正祛邪。對癥狀的改善是中醫治療的優勢[13]，課題組經過近40年臨床與實驗研究篩選出一組改善骨髓抑制的有效組穴：大椎，膈俞，腎俞，足三里。大椎為陽經交匯之處，與督脈交于后項部，可祛邪外出，激發陽氣，恢復正氣；膈俞，乃八會穴之血會，《醫學入門》：“膈俞……主一切血疾”；腎俞固本培元，益髓填精，激發臟腑原氣；足三里，胃腑下合穴，《流注指要賦》言：“三里卻五勞之羸瘦”。諸穴配伍精妙，穴精效顯，使獲補脾益腎、益氣活血、扶正祛邪之成。

Notch路徑遍布于動物組織以及器官中，Notch路徑的正常傳輸對新陳代謝自我更新以及細胞增殖、分化和凋亡等多種有機體活動中扮演關鍵職能[14]，還對造血干細胞的增殖分化有一定的調節作用[15]，國內外大量研究表明Notch路徑與腫瘤化療所致骨髓抑制息息相關。VARNUM-FINNEY等[16]發現Notch路徑通過對其受體notch2和配體之一jagged1的干預，使得化療后小鼠重度骨髓抑制情況改善，并恢復其造血能力。由此表明，notch2和jagged1作為Notch路徑上的重要因子不僅能調節造血功能還對惡性腫瘤化療后所致骨髓抑制扮演關鍵調控角色。Numb在唾液腺腫瘤、乳腺癌、膀胱癌以及食管癌等多種腫瘤組織結構中表現出水準差異的轉錄翻譯過程[17]。有研究發現Numb不僅對細胞命運起支配性作用，同時主導Notch信號通路的逆反饋調節，二者之間的平衡能確定細胞分化的方向，Numb還可通過自身PTB結構域與Notch路徑胞內結構域及C端序列的結合相互影響，拮抗Notch的生理學功能[18]。Numb同時干預Notch到細胞內的傳送途徑，進而下調Notch信號傳導。研究發現[19]，Numb引起Notch或NICD的內吞，并分離出Notch的整個長度或部分長度，從而達到抑制Notch信號傳導途徑的目的。亦有研究揭示Numb憑借阻止Notch路徑上相關基因興奮發揮抑癌功效，抑制腫瘤的發生發展[20]。由此可表明，Notch路徑上的關鍵信息基因是針灸改善或緩解CTX化療所致骨髓抑制的重要路徑。

本次研究結果從小鼠一般狀況、白細胞計數以及基因3個層面得知，除荷瘤空白組外，其余3組小鼠注射CTX后，由于CTX其嚴重的毒副作用導致每組小鼠一般狀況較差，白細胞計數下降以及每組小鼠骨髓細胞中Notch路徑上的關鍵差異基因numb1、numb2 mRNA低表達，基因notch2、jag1 mRNA高表達，致 Notch路徑居于異常極度啟動的狀況，不但引起骨髓造血干/祖細胞增殖功能削弱，還矛盾地使它們分化，以致造血干/祖細胞的數目大為降低，降低了骨髓造血功能，更干擾細胞正常運行，引起骨髓抑制，進一步抑制Notch信號路徑，降低該造血重建能力。治療組分別施以針療與灸療后，小鼠一般情況得到緩解，白細胞計數大幅度提升且在治療第5天幾乎與基礎白細胞水平持平，Notch路徑上關鍵差異基因轉錄情況得到調節，從而抑制了異常過度激活的Notch路徑。由此可見針灸可以憑借對Notch路徑關鍵差異基因的調控來減弱因環磷酰胺化療引起的骨髓抑制，從基因轉錄的角度說明了Notch信號通路是針灸緩解化療后骨髓抑制，提升WBC的重要路徑。本次選用S180植瘤小鼠，體質更貼合臨床腫瘤病患，為臨床診治提供了科學的實驗基礎。