辛溫通陽中藥蔥白提取物對高脂血癥模型大鼠線粒體代謝相關限速酶表達的影響

馮云霞，張維麗，謝沛霖，朱旭，趙曉雯

(武漢市中西醫結合醫院，湖北 武漢 430022)

高脂血癥是一種脂質代謝異常狀態的慢性代謝性疾病，其特征是脂質含量水平的失衡，其中包括血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)升高和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低[1]。隨著近些年生活條件的改變，動物產品的高消耗量和人們的運動消耗不足導致高脂血癥發病率顯著增加，嚴重威脅著人們的健康。高脂血癥被認為是慢性炎癥和動脈粥樣硬化的誘因，能夠增加冠心病和缺血性中風的患病幾率[2-3]，因此，對高脂血癥的發病機理和治療的研究十分重要。在血脂的代謝方面，線粒體作為細胞能量的代謝中心，在參與其代謝中發揮重要作用[4]。線粒體內含有多種限速酶，它們的作用主要包括嘧啶和血紅素合成、氧化磷酸化、自由基生成和解毒、膽固醇和神經遞質代謝，以及凋亡程序的執行等[5]。目前，線粒體內的限速酶是高脂血癥的發病機理的新的重要研究方向。

目前對高脂血癥的治療手段通常是西醫治療，而在我國，中藥聯合西藥治療效果更顯著[6]。蔥白提取物是從蔥科植物細香蔥AlliumschoenoprasumL.成熟莖下端蔥白中提取的一類活性成分，其中含有多種硫化物、甾體皂苷、揮發油、黃酮類、微量元素等，屬于辛溫通陽類中藥[7-8]。已有研究表明蔥白可以有效抗氧化損傷、改善缺血心肌的能量代謝、減少炎癥因子分泌及調節血脂[9-11]。因此本課題以高脂血癥大鼠模型為研究對象，灌胃蔥白提取物予以治療，初步探討蔥白提取物對線粒體代謝相關限速酶基因的調節作用及機制，為臨床上高脂血癥的治療領域提供理論與實驗基礎。

1 材料

1.1 動物

健康雄性6周齡SD大鼠30只，體質量180～220 g，實驗動物使用許可證號：SYXK(鄂)2018-0104；于22～26 ℃，相對濕度50%～60%的飼養條件下進行飼養，12 h交替照明。在本次實驗過程中，按照《實驗動物管理條例》等相關文件標準進行飼養與處置。所有動物實驗均符合動物管理委員會《實驗動物倫理證》的相關規定。

1.2 試劑與儀器

戊巴比妥鈉(sigma merck公司)；膽固醇、膽酸鈉、甲基硫氧嘧啶、吐溫-80、丙二醇及辛伐他汀(阿拉丁公司)；豬油(展藝公司)；蔥白提取物(武漢市第一醫院)；TC試劑盒、TG試劑盒(南京建成公司)；SYBR FAST qPCR Master Mix(KAPA Biosystems公司)；硝酸纖維素轉移膜、化學發光試劑(millipore公司)；組織細胞快速裂解液、蛋白濃度測定試劑盒(solarbio公司)；HK1、COX-2、CS、CPTl、Cyc-C、GADPH蛋白一抗、山羊抗兔蛋白二抗(bioswamp公司)；全自動生化分析儀(型號BS-420，深圳邁瑞公司)；熒光定量PCR儀(型號CFX-Connect 96，Bio-Rad公司)；全自動化學發光分析儀(型號Tanon-5200，上海天能公司)。

2 方法

2.1 大鼠高脂血癥模型構建

設置5只為對照組，不進行任何處理。另外25只SD大鼠采用脂肪乳灌胃法構建大鼠高脂血癥模型。脂肪乳根據文獻[12]方法制備：膽固醇10%、豬油20%、膽酸鈉2%、甲基硫氧嘧啶1%、吐溫-80 20%、丙二醇30%、加水至100%。按照脂肪乳10 mL/(kg·d)灌胃，10 d即可造成高脂血癥模型。造模10 d后，收集大鼠血清,全自動生化檢測血清內TC及TG含量進行模型鑒定。

2.2 分組及給藥

除對照組外，將構建成功的高脂血癥模型大鼠隨機分為5組，每組5只,模型組、蔥白低劑量組、蔥白中劑量組、蔥白高劑量組、辛伐他汀組。對照組與模型組大鼠每天分別灌胃生理鹽水，蔥白低、中、高劑量組灌胃蔥白提取物(劑量分別為25 mg/kg、50 mg/kg、75 mg/kg)，辛伐他汀組灌胃辛伐他汀(100 mg/kg)，連續灌喂4周。于給藥第12周末處死動物，大鼠3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40 mg/kg)，取血后，戊巴比妥鈉過量麻醉致死(100 mg/kg)，以動物無呼吸無心跳判斷動物死亡。觀察記錄肝組織重量，收集各組大鼠的肝臟、血清樣本備用。

2.3 大鼠血清TG、TC、LDL和HDL含量檢測

于4 ℃溶解待測血清樣本，采用深圳邁瑞BS-420 型全自動生化分析儀檢測大鼠血清中TG、TC、LDL和HDL的含量，檢測試劑為深圳邁瑞配套生化試劑盒。

2.4 RT-PCR法檢測各組大鼠肝臟組織中線粒體代謝相關基因

取各組大鼠肝臟組織樣本100 mg于裝有1 mL的Trizol的勻漿管中，于勻漿機勻漿20 s，立即放于冰上，抽提總RNA進行反轉錄，再按照 SYBR GREEN PCR Kit 說明書進行 RT-PCR 法檢測大鼠肝臟組織中HK1、COX-2、CS、CPTl、Cyc-C的mRNA表達情況。引物序列見表1。以GAPDH作為內參，用GAPDH的Ct歸一目標基因的Ct得△Ct，其次用校準樣本的△Ct歸一樣品的△Ct，最后計算表達水平比率：2-△△Ct=表達量的比值。根據RT-qPCR結果篩選高表達HOXB-AS3基因的細胞進行后續實驗。

表1 引物序列信息

2.5 Western blot法檢測各組大鼠肝臟組織中線粒體代謝相關蛋白的表達水平

將肝臟組織剪成細小的碎片，按每20 mg組織加入200 μL裂解液的比例加入裂解液(裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑)，勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4 ℃ 12 000 r/min 離心15 min，取上清，按照試劑盒說明書測定蛋白質濃度。將各組樣品于10%的SDS-PAGE電泳，電轉至硝酸纖維素膜。硝酸纖維素膜放入5%的脫脂牛奶中，于室溫搖床封閉2 h。分別加入一抗HK1(1∶1 000)、COX-2(1∶1 000)、CS(1∶1 000)、CPTl(1∶1 000)、Cyc-C(1∶1 000)、GADPH(1∶1 000)于4 ℃孵育過夜。洗膜3次后，孵育山羊抗兔二抗(1∶10 000)，室溫1 h。洗膜3次后，將膜放置在暗室中，根據用量取發光液混勻，加在膜的正面與之充分接觸。然后將膜置于全自動化學發光分析儀中檢測，通過TANON GIS軟件讀取相關條帶灰度值。

2.6 統計學處理

采用SPSS 19.0進行數據分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較使用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 蔥白提取物對高脂血癥模型大鼠血清TG、TC、LDL和HDL含量的影響

飼喂4周后，與對照組相比，模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平顯著升高(P<0.05)，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)；給藥4周后，與模型組相比，蔥白高劑量組顯著降低TC、TG和LDL-C水平(P<0.05)，顯著升高HDL-C水平(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清TG、TC、LDL和HDL含量檢測結果

3.2 蔥白提取物對高脂血癥模型大鼠肝臟中線粒體代謝相關基因表達的影響

與對照組相比，模型組大鼠肝臟中COX-2 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，HK1、CS、CPT1、Cyc-C mRNA表達則顯著下降(P<0.05)。給藥4周后，與模型組相比，蔥白低、中、高劑量組與辛伐他汀組均能下調COX-2基因表達，上調HK1、CS、CPT1與Cyc-C基因mRNA表達，且蔥白提取物治療組呈現一定的劑量依賴關系。其中，蔥白高劑量組中COX-2 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，而HK、CS、CPT1及Cyc-C的mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠線粒體代謝相關基因表達變化

3.3 蔥白提取物對高脂血癥模型大鼠肝臟中線粒體代謝相關蛋白表達水平的影響

與對照組相比，模型組大鼠肝臟中COX-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，HK1、CS、CPT1及Cyc-C蛋白表達水平則顯著下降(P<0.05)。給藥4周后，與模型組相比，蔥白低、中、高組與辛伐他汀組均能減少COX-2蛋白表達，增加HK1、CS、CPT1與Cyc-C蛋白表達，且蔥白提取物治療組呈現一定的劑量依賴關系。其中，蔥白高劑量組中COX-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，而HK1、CS、CPT1及Cyc-C的蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，見表4、圖1。

表4 各組大鼠線粒體代謝相關蛋白表達變化

4 討論

高脂血癥已被列為冠心病患病和危害機體嚴重程度的最大危險因素之一，且高脂血癥相關的脂質紊亂被認為是動脈粥樣硬化性心血管疾病的原因[13]，因此治療高脂血癥可為預防冠心病等心腦血管疾病提供有效保護。對引起高脂血癥的危險因素進行識別、評估和管理，以預防嚴重后果，能夠大幅提高現代人的健康。目前中醫治療高脂血癥有獨特的優勢，不僅能有效降低血脂水平，而且藥效溫和、不良反應少[14]。本研究顯示，蔥白提取物治療組與辛伐他汀均可降低大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平且升高HDL-C水平。

線粒體是真核生物進行氧化代謝的部位，是糖類、脂肪和氨基酸最終氧化釋放能量的場所，其最主要的功能是通過氧化磷酸化途徑合成ATP為機體供能[15]。線粒體功能受損會導致神經系統疾病、心血管系統疾病、肝臟疾病等多種疾病[16-17]，而線粒體功能障礙主要表現在線粒體形態結構的改變、活性氧物種的過度產生、ATP合成減少和酶表達失常等。環氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)、己糖激酶(hexokinase,HK1)、肉毒堿棕櫚酰轉移酶1(carnitine palmitoyl—transferase 1,CPTl)、檸檬酸合酶(citrate synthase,CS) 和細胞色素C(cytochrome C,Cyc-C)都是線粒體中的重要限速酶，在線粒體中體現其氧化和代謝能力。COX-2是一種能夠誘導脂質過氧化反應的誘導型酶，其表達增加通常可能發生于脂質在回腸消化吸收過多引起脂肪代謝紊亂[18]；HK1是糖代謝中起主要作用的酶，其活性與線粒體活性密切相關[19]；CPT1和長鏈脂肪酸的代謝相關，主要對長鏈脂肪酸由胞漿轉移到線粒體進行氧化供能，其表達的上調提示脂肪在肝細胞中的氧化程度提高[20]；CS則是三羧酸循環中的重要限速變構酶，主要參與細胞內的膽固醇代謝；Cyc-C則是生物氧化過程中重要的電子傳遞體，主要參與細胞呼吸，增強氧化磷酸化功能，為機體提供能量。在本研究中，高脂血癥模型大鼠經蔥白提取物與辛伐他汀分別治療后，COX-2的mRNA與蛋白表達均減少，且蔥白低、中、高劑量組間呈現一定的劑量依賴性，表明蔥白提取物能緩解機體的脂肪代謝紊亂，控制脂質代謝。而與高脂血癥模型組相比，蔥白低、中、高劑量組與辛伐他汀組的HK1、CPT1、CS與Cyc-C的mRNA與蛋白表達均有所增加，證實蔥白提取物能活化線粒體功能，促進脂肪氧化及膽固醇代謝，減少細胞中脂質積累。

綜上所述，蔥白提取物能通過調節線粒體代謝相關限速酶的表達，從而促進脂肪酸氧化，調節高脂血癥模型大鼠血清中的血脂水平，提示蔥白提取物有作為治療高脂血癥藥物的潛力，其作用機制有待后續的深入研究。