玉米須提取物對小鼠糖尿病足模型的炎癥干預(yù)作用研究

孫秋，閆禹竹，王海英，王俊志*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱市第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150056)

糖尿病的各種血管疾病并發(fā)癥中，以動脈硬化性閉塞病癥最為嚴(yán)重[1]，糖尿病的周圍動脈硬化發(fā)展快、程度高[2]，后果嚴(yán)重，一旦發(fā)生壞疽，其截肢率是不患糖尿病患者的40倍。糖尿病性動脈硬化閉塞癥初始表現(xiàn)為缺血，繼而由于足應(yīng)力、外傷等因素出現(xiàn)感染和神經(jīng)病變，形成嚴(yán)重下肢病變即為糖尿病足(Diabetic Foot，DF)，最終可致肢體截肢，有統(tǒng)計顯示一側(cè)截肢的患者，三年后約有將近1/3需再行對側(cè)肢體截肢[3]。玉米須是我國歷史悠久的中藥材，夏、秋玉米果實(shí)成熟時收集后除去雜質(zhì)，鮮用或曬干生用，《中藥學(xué)》教材記載其甘淡滲泄、功專利水滲濕消腫，藥性平和、能利濕而退黃，故陰黃陽黃均可應(yīng)用[4]。現(xiàn)代藥理表明玉米須含有揮發(fā)油、脂肪油、樹脂、生物堿、皂苷、檸檬酸等[5]，具有較強(qiáng)的抑菌、利尿、降壓、降糖、降脂、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級昆明種小鼠150只，體質(zhì)量(24.0±3.0)g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號為SYXK(黑)2013-012。實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)溫度和相對濕度分別為20～26 ℃、40%～70%，實(shí)驗(yàn)開始前所有小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水[6]。

1.2 藥物與試劑

鏈脲佐菌素(STZ)、檸檬酸購自西格瑪公司；血糖儀和血糖試紙購自羅氏診斷公司。白細(xì)胞介素-1(IL-1)、超敏反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)試劑盒由武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司提供。

1.3 儀器

超聲波粉碎機(jī)(上海凈信，XM-650T)；水浴恒溫振蕩器(精達(dá)儀器，HZS-HA)；超低溫冰箱(博科，BDF-86V398)；電子天平(德國Sartorius，BSA224S)；高速離心機(jī)(中國Anke，TGL-20B)；全自動酶標(biāo)儀(賽默飛世爾，Multiskan FC)[6]。

2 方法

2.1 玉米須提取方法

將0.2 kg干燥玉米須用超聲波粉碎機(jī)粉碎，將玉米須融入50 ℃的1.5 L蒸餾水中使用水浴恒溫振蕩器提取2遍，濾渣后收集玉米須濾液，濾液放置高速離心機(jī)內(nèi)離心后留取上清液，水浴80 ℃濃縮后置真空干燥器內(nèi)至水分干燥完全，得到玉米須濃縮水溶性提取物，密封至-80 ℃超低溫冰箱存儲備用。使用時，以蒸餾水溶解提取物即得玉米須提取物水溶液[6-7]。

2.2 實(shí)驗(yàn)動物造模

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨后150只小鼠隨機(jī)分成5組，分別為空白對照組，模型對照組，玉米須提取液高、中、低劑量組，每組30只。空白對照組繼續(xù)進(jìn)行基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，模型對照組及玉米須提取液高、中、低劑量組給予高脂高糖飲食飼料喂養(yǎng)。除空白對照組外，其余4組在第12周使用鏈脲佐菌素(STZ)進(jìn)行DF模型造模，開始造模前12 h小鼠禁食但可自由飲水，將STZ放入到pH值為4.2檸檬酸(濃度為0.1 mmol/L)溶解，之后的5 d按照40 mg·kg-1·d-1劑量給造模小鼠行腹腔注射，造模成功標(biāo)準(zhǔn)為小鼠空腹6 h血糖值>11.1 mmol/L[6-7]。

2.3 給藥方法

玉米須提取物不同劑量組按照高劑量組400 mg/kg、中劑量組200 mg/kg、低劑量組100 mg/kg，分別配置治療液濃度為20 g/L、10 g/L、5 g/L，按照0.02 mL/g標(biāo)準(zhǔn)灌胃，空白及模型對照組給予等體積生理鹽水，持續(xù)用藥30 d，第30天給藥后1 h，禁食12 h后行尾部采血指標(biāo)檢測[6-7]。

2.4 檢測指標(biāo)

觀察小鼠用藥前后的血糖、炎癥因子白細(xì)胞介素-1(IL-1)、超敏反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)、細(xì)胞間牲附分子-1(ICAM-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的指標(biāo)含量變化。

2.5 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 小鼠DF模型成功標(biāo)準(zhǔn)

給藥前各造模組血糖值均>11.1 mmol/L表示造模成功，同空白對照組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，課題組前期已發(fā)表過關(guān)于血糖對比情況文章，此處不再贅述[6-8]。

3.2 玉米須提取液對DF小鼠IL-1、hs-CRP炎癥因子影響

根據(jù)表1可知，給藥前空白對照組與各造模組IL-1、hs-CRP炎癥因子比較有明顯差異(P<0.01)。給藥后玉米須提取物高、中、低劑量組與模型對照組相比，均具降低IL-1、hs-CRP炎癥因子的作用(P<0.01)，且呈現(xiàn)玉米須提取物劑量濃度依賴性，玉米須提取物高劑量組要明顯優(yōu)于低劑量組(P<0.05)。

表1 玉米須提取液對DF小鼠IL-1、hs-CRP炎癥因子影響

3.3 玉米須提取液對DF小鼠VCAM-1、ICAM-1、MCP-1的影響

根據(jù)表2可知，用藥前空白對照組與各造模組VCAM-1、ICAM-1、MCP-1因子比較有明顯差異(P<0.01)。給藥后玉米須提取物高、中、低劑量組與模型對照組相比均具降低VCAM-1、ICAM-1、MCP-1的作用(P<0.01)，且呈現(xiàn)玉米須提取物劑量濃度依賴性，玉米須提取物高劑量組要明顯優(yōu)于低劑量組，組間對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 玉米須提取液對DF小鼠VCAM-1、ICAM-1、MCP-1影響

4 討論

糖尿病足是糖尿病神經(jīng)病變和血管病變引發(fā)的合并癥，進(jìn)而引起肢體感染、潰瘍、壞疽形成，甚至可導(dǎo)致深層組織破壞終致截肢[9]。血管病變在糖尿病足的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等方面起著至關(guān)重要的作用[10]，血管的炎癥反應(yīng)是糖尿病血管并發(fā)癥的始發(fā)和促動因素，其參與整個血管病變的全程[11]。越來越多的研究表明，糖尿病足不僅是高血糖的疾病，也是一種炎癥反應(yīng)性疾病，炎癥因子在糖尿病足及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展、演變中起到媒介作用[12]。在糖尿病足的發(fā)病過程中，會激發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)，內(nèi)皮細(xì)胞激活導(dǎo)致黏附分子表達(dá)，如VCAM-1、ICAM-1因子，吸引炎性細(xì)胞因子如單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等到達(dá)較早期的損傷部位[13]。細(xì)胞內(nèi)炎性信號通路在動脈粥樣硬化斑塊中的免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等多類型細(xì)胞內(nèi)激活及表達(dá)起到至關(guān)重要的作用，各類細(xì)胞受其調(diào)節(jié)分泌黏附分子(如VCAM-1、ICAM-1等)，趨化因子(如MCP-1)，促炎性細(xì)胞因子(如IL-1β、IL-6等)釋放，參與糖尿病性動脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展[13]。hs-CRP作為一種炎癥性刺激時的急性相蛋白，其在機(jī)體受到微生物入侵或組織損傷等情況下由肝細(xì)胞合成，是動脈硬化性血管疾病的獨(dú)立危險因子，是血管并發(fā)癥的預(yù)測因素，其水平的升高與血管并發(fā)癥有顯著的相關(guān)性[14]。IL-1作為一種敏感的炎性急性期指標(biāo)，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞同白細(xì)胞之間的黏附，參與血管機(jī)能調(diào)節(jié)，促進(jìn)血管平滑肌不同程度地增生、增加血管內(nèi)膜通透性，同時可誘導(dǎo)纖溶抑制因子和凝血系統(tǒng)激活因子基因表達(dá)，誘導(dǎo)炎癥因子中性粒細(xì)胞向血管內(nèi)皮下移行[13]。

中醫(yī)認(rèn)為糖尿病足屬于“消渴”“脫疽”范疇，病因病機(jī)為正虛、血瘀、毒聚，虛以氣虛、陰虛為主，實(shí)以氣滯血瘀、濕熱壅盛為主，日久內(nèi)阻氣機(jī)，氣血不生，外蘊(yùn)肌膚，壅滯經(jīng)絡(luò)，氣血不通至肢體失養(yǎng)。當(dāng)以補(bǔ)虛化瘀、解毒通絡(luò)為治療大法[15]。古代醫(yī)學(xué)關(guān)于本病的記載極為豐富，宋代《圣濟(jì)總錄》中有很多關(guān)于“消渴”癥狀的描述，如“飲水不輟，飲食過人而不覺飽”等，同時還指出“能食而渴者必發(fā)腦癰，背癰”，元代羅天益《衛(wèi)生寶鑒》曰：“足發(fā)惡瘡，至死不救”。把發(fā)生于肢體末端的癰疽，歸屬于“脫疽”，這些描述說明古代醫(yī)家已經(jīng)認(rèn)識到糖尿病可以并發(fā)肢體壞疽，并且對其有了深刻的研究[1，16]，本病嚴(yán)重影響患者的基本生活質(zhì)量并給患者帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和長期的精神痛苦[7]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與模型對照組比較，經(jīng)玉米須提取液給藥后，高、中、低劑量組與DF小鼠模型相比較均具有降低IL-1、hs-CRP的作用(P<0.01)，且呈現(xiàn)玉米須提取物劑量濃度依賴性，高劑量治療組要明顯優(yōu)于低劑量治療組降低IL-1、hs-CRP的作用，治療組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。給藥后玉米須提取物高、中、低劑量組與DF小鼠模型對照組相比均具降低VCAM-1、ICAM-1、MCP-1的作用(P<0.01)，且呈現(xiàn)玉米須提取物劑量濃度依賴性，高劑量治療組要明顯優(yōu)于低劑量治療組降低VCAM-1、ICAM-1、MCP-1的作用，治療組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，糖尿病足的病理主要與糖代謝異常、炎癥因子的反應(yīng)相關(guān)，玉米須提取液可不同程度地降低FBG、IL-1、hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1，改善小鼠的炎癥狀態(tài)，尤其是高劑量組的各項指標(biāo)改善最為明顯。本研究結(jié)果提示，炎癥因子和炎癥反應(yīng)參與糖尿病足的病理過程，玉米須提取液可以降低血糖、抑制炎癥因子的釋放，改善血管炎癥狀態(tài)，有利于糖尿病足的恢復(fù)。通過此項研究期望可以通過玉米須這種最普通的、藥食同源的藥物得到更多的啟發(fā)，降低糖尿病足的治療成本，發(fā)揮更好的社會經(jīng)濟(jì)效應(yīng)，為北藥開發(fā)提供一定的力量。