Brusatol去羥甲基化修飾抑制IDH1-α-KG-TET1-Nrf2信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)I型子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥研究

田淑娜 胡美燕 張?bào)鸩?陳雄 陳琪珍

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見的三大惡性腫瘤之一，根據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年美國(guó)子宮內(nèi)膜癌新發(fā)65 620例，死亡12 590例，子宮內(nèi)膜癌患者新增人數(shù)遠(yuǎn)大于宮頸癌、卵巢癌，死亡人數(shù)僅次于卵巢癌[1-2]。子宮內(nèi)膜癌根據(jù)其病理特點(diǎn)及臨床表現(xiàn)分為Ⅰ和Ⅱ型。Ⅰ型即雌激素依賴型，常見于50～60歲婦女，是由于長(zhǎng)期無(wú)孕激素拮抗的雌激素過度刺激有關(guān)，對(duì)孕激素治療效果好，大部分由子宮內(nèi)膜增生尤其是不典型增生形成，腫瘤分化程度高、預(yù)后好[3]。Ⅱ型即非雌激素依賴型，多發(fā)生于萎縮性子宮內(nèi)膜，腫瘤分化程度低，預(yù)后差。對(duì)于年輕有生育需求的早期子宮內(nèi)膜癌患者以及晚期、轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的子宮內(nèi)膜癌患者，孕激素是目前子宮內(nèi)膜癌保守治療的重要藥物。但部分患者存在孕激素耐藥現(xiàn)象，嚴(yán)重影響子宮內(nèi)膜癌保守治療的效果，因此臨床采用孕激素保守治療子宮內(nèi)膜癌需謹(jǐn)慎評(píng)估[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子（nuclear factor erythroid related factor 2,Nrf2）和異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase 1,IDH1）在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常增殖期子宮內(nèi)膜組織。Nrf2高表達(dá)促進(jìn)孕激素耐藥的發(fā)生，而下調(diào)Nrf2可增加子宮內(nèi)膜癌對(duì)孕激素的反應(yīng)性。IDH1是三羧酸循環(huán)中的一種重要酶，其功能是將異檸檬酸氧化脫羧轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸（α-ketoglutarate,α-KG）。TET1蛋白是α-KG依賴的雙加氧酶，它可以催化5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine,5-mC）轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine,5-hmC），是DNA去甲基化過程中一種重要的酶，對(duì)于維持干細(xì)胞的多能性有重要作用。IDH1的突變可導(dǎo)致TET1不能使5-mC轉(zhuǎn)化為5-hmC。IDH1-α-KG-TET1-Nrf2信號(hào)通路可能與Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥發(fā)生機(jī)制有關(guān)[5]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)中草藥提取物鴉膽子苦醇Brusatol能抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和活性[6]。文獻(xiàn)報(bào)道，Brusatol能抑制包括子宮內(nèi)膜癌在內(nèi)的癌癥中Nrf2的表達(dá)，Nrf2通過下游靶基因AKR1C1介導(dǎo)的孕激素調(diào)控導(dǎo)致孕激素耐藥，促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生[7-8]。本研究旨在通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討B(tài)rusatol能否抑制Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌逆轉(zhuǎn)孕激素耐藥及其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa細(xì)胞由上海市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室提供。NU/NU裸鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，均為雌性，鼠齡 6～8周，重20～24 g。小鼠均在無(wú)特定病原體（SPF）條件下飼養(yǎng)。Brusatol、醋酸甲羥孕酮（medroxyprogesterone acetate,MPA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，IDH1、α-KG、TET1單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Nrf2購(gòu)自美國(guó)Santa公司，5-hmC抗體購(gòu)自美國(guó)Active Motif公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自德國(guó)Millipore公司，DMEMF12培養(yǎng)基、FBS均購(gòu)自美國(guó)Gibico公司，青霉素和鏈霉素購(gòu)自中國(guó)賽默飛世爾公司，Western blot一抗稀釋液、Western blot二抗稀釋液、胰蛋白酶、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司，RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑-磷酸酶抑制劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific有限公司，DNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司，ECL化學(xué)發(fā)光劑購(gòu)自德國(guó)Millipore公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) Ishikawa細(xì)胞用含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基在濕化的、含5%二氧化碳、37℃的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)原代Ishikawa細(xì)胞進(jìn)行分離和培養(yǎng)。

1.3 子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤模型的建立和處理

1.3.1 子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤模型的建立 將Ishikawa細(xì)胞移植至20只裸鼠。在無(wú)菌條件下，待Ishikawa細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，使用一次性1 ml無(wú)菌注射器抽取Ishikawa細(xì)胞懸液（0.25%胰酶消化后配成），注射于裸鼠右側(cè)腋下皮下組織，每只裸鼠注射細(xì)胞懸液200 μl（約含1×107個(gè)細(xì)胞），移植后1周左右可見腫瘤生長(zhǎng)。

1.3.2 模型祼鼠的分組和處理 在裸鼠移植Ishikawa細(xì)胞2周后，腫瘤長(zhǎng)徑達(dá)到0.5～1 cm，將20只裸鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組5只。空白對(duì)照組、Brusatol組、MPA組、Brusatol+MPA組裸鼠分別經(jīng)腹腔注射0.1 ml 0.9%氯化鈉注射液、2 mg/kg Brusatol、100 mg/kg MPA、2 mg/kg Brusatol+100 mg/kg MPA，均為3次/周，共9次。

1.4 裸鼠移植瘤抑制率觀察 4組裸鼠移植Ishikawa細(xì)胞后每3 d測(cè)量1次裸鼠皮下移植瘤的長(zhǎng)徑a和短徑b。腫瘤體積=a×b2×0.52。用藥干預(yù)3周后，采用頸椎脫臼法處死4組成瘤裸鼠，所有移植瘤均位于裸鼠的右側(cè)腋下皮下，呈卵圓形突起，表面皮膚光滑完整，大部分移植瘤包膜完整，與瘤體周圍組織薄膜狀粘連，質(zhì)地較韌，容易整體剝離。超凈手術(shù)操作臺(tái)上切開右側(cè)腋下皮下組織，完整剝出移植瘤，計(jì)算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率=（空白對(duì)照組腫瘤體積-實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積）/空白對(duì)照組腫瘤體積×100%。

1.5 Ishikawa細(xì)胞提取 從-80℃冰箱中取出4組裸鼠移植瘤組織，置于冰袋上，使用消毒的剪刀剪取適宜大小的組織塊，稱取25 mg組織于冰袋上剪碎，置于預(yù)冷的勻漿器中，加入500 μl預(yù)冷的PBS，于冰浴中碾碎組織，用剪去尖端的1 ml tip頭吸取組織液于1.5 ml的EP管中，置于冰盒上，再加500 μl的預(yù)冷的PBS于勻漿器，把殘余的組織進(jìn)一步收集于同一EP管中，Ⅰ型膠原酶消化，置于37℃、5%二氧化碳環(huán)境持續(xù)3 h；反復(fù)吹打培養(yǎng)皿中的顆粒樣組織并移至15 ml離心管，1 000 r/min離心5 min，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后分別以100、40 μm濾網(wǎng)過濾；濾過40 μm濾網(wǎng)的為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，直徑介于40～100 μm為Ishikawa細(xì)胞，使用10%FBS穩(wěn)定濾過目標(biāo)細(xì)胞得到Ishikawa細(xì)胞。

1.6 4組移植瘤組織IDH1-α-KG-TET1-Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 同前處理裸鼠移植瘤組織后，采用Western blot法，用RIPA裂解緩沖液提取各組總蛋白。BCA測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，將提取的組織總蛋白中加入等體積2×SDS混勻，100℃持續(xù)10 min，將蛋白質(zhì)完全變性，置于-20℃保存。將50 μg蛋白質(zhì)裝載到SDS聚丙烯酰胺凝膠中，電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后分別與針對(duì)IDH1、α-KG、TET1、Nrf2的一抗4℃孵育過夜。將PVDF膜置于5%脫脂奶粉（TBST配制）中進(jìn)行封閉1 h。洗膜后室溫下孵育對(duì)應(yīng)的二抗1 h，使用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)（曝光液A、B等體積混合）檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 4組Ishikawa細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用CCK-8法。將各組Ishikawa細(xì)胞以105個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，將足量的細(xì)胞混懸液加入到10 cm的細(xì)胞皿中，用排槍輕柔吹打混勻后快速進(jìn)行接種，每孔100 μl，每接種1排孔就再次用排槍輕柔吹打細(xì)胞混懸液以保證細(xì)胞種板均勻。將種植好的細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，用排槍小心并均勻地向每個(gè)待測(cè)孔中加入10 μl CCK-8溶液。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～4 h。酶標(biāo)儀測(cè)定其在450 nm處的光密度（OD值）以反映細(xì)胞增殖能力。

1.8 4組Ishikawa細(xì)胞TET1羥甲基化水平檢測(cè) 采用Dot blot法。4組Ishikawa細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種在6孔板中，并培養(yǎng)至95%的融合度時(shí)取出細(xì)胞，用PBS清洗1～2次，吸盡殘余的PBS，加入胰酶消化，待完全消化后，迅速加入完全培養(yǎng)基消化，吸入1.5 ml離心管中，再次使用PBS清洗，直至胰酶完全被清除。按試劑盒說明書提取細(xì)胞DNA。將提取DNA滴在硝酸纖維素膜上。80℃下烘焙10 min后，用10%脫脂牛奶封閉膜1 h，然后在4℃下與5-hmC一抗孵育過夜。PBS洗3次，5 min/次，放入稀釋好的二抗中，室溫下孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光液顯影，將ECL顯影后的條帶使用美藍(lán)染色1～2 s，立即將條帶放搖床上用清水清洗，以美藍(lán)染色的結(jié)果作為內(nèi)參照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組裸鼠腫瘤抑制率比較 Brusatol組、MPA組、Brusatol+MPA組裸鼠腫瘤抑制率分別為（30.24±1.52）%、（50.37±2.36）%、（72.56±3.82）%，Brusatol+MPA組＞MPA組＞Brusatol組＞空白對(duì)照組，4組裸鼠腫瘤抑制率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 4組移植瘤組織IDH1、α-KG、TET1、Nrf2蛋白表達(dá)水平比較 Brusatol+MPA組IDH1、α-KG、TET1、Nrf2蛋白表達(dá)水平均低于MPA組、Brusatol組、空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MPA組、Brusatol組蛋白水平低于空白對(duì)照組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MPA組與Brusatol組蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見圖1、表1。

圖1 4組移植瘤組織IDH1、α-KG、TET1、Nrf2蛋白表達(dá)電泳圖

表1 4組移植瘤組織IDH1、α-KG、TET1、Nrf2蛋白表達(dá)水平比較

2.3 4組Ishikawa細(xì)胞增殖能力比較 Brusatol+MPA組Ishikawa細(xì)胞增殖能力均低于MPA組、Brusatol組、空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；MPA組、Brusatol組細(xì)胞增殖能力均低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；MPA組細(xì)胞增殖能力弱于Brusatol組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 4組Ishikawa細(xì)胞增殖能力比較

2.4 4組Ishikawa細(xì)胞TET1羥甲基化水平比較 Brusatol+MPA組Ishikawa細(xì)胞TET1羥甲基化水平均低于MPA組、Brusatol組、空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；MPA組、Brusatol組TET1羥甲基化水平均低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；MPA組TET1羥甲基化水平低于Brusatol組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 4組Ishikawa細(xì)胞TET1羥甲基化水平Dot blot檢測(cè)顯影圖

3 討論

子宮內(nèi)膜癌為女性生殖系統(tǒng)常見腫瘤之一，近年來(lái)，由于生活環(huán)境、工作壓力等因素的影響，子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率逐年增加，同時(shí)有年輕化趨勢(shì)。對(duì)于部分育齡期女性，有強(qiáng)烈保留生育功能的意愿，這使子宮內(nèi)膜癌患者的保守治療受到臨床醫(yī)療界的廣泛關(guān)注。孕激素治療是保留生育功能的重要治療方式[9]。MPA是子宮內(nèi)膜癌患者保守治療中最常見的孕激素，但是大約30%的患者對(duì)孕激素治療敏感性較低，甚至耐藥，最終致使保守治療失敗。雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)孕激素耐藥進(jìn)行了大量研究，但仍不能明確其具體機(jī)制，目前尚無(wú)有效的治療策略克服孕激素耐藥。基于國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究及本課題組的前期工作，Nrf2和IDH1在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)水平顯著高于正常增殖期子宮內(nèi)膜組織，IDH1-α-KG-TET1-Nrf2信號(hào)通路可能與Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥機(jī)制有關(guān)。Brusatol為中草藥提取物，具有清熱、解毒、降糖、抗腫瘤等作用[10]，研究發(fā)現(xiàn)Brusatol能抑制白血病細(xì)胞及肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[11-12]，本課題組也發(fā)現(xiàn)Brusatol能抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和活性[13]。本課題組擬進(jìn)一步驗(yàn)證Brusatol可以通過抑制IDH1-α-KG-TET1-Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，提高子宮內(nèi)膜癌組織對(duì)孕激素治療的敏感性，以發(fā)掘預(yù)測(cè)和影響子宮內(nèi)膜組織激素敏感性的生物標(biāo)志物，指導(dǎo)臨床合理開展激素治療及尋求逆轉(zhuǎn)孕激素耐藥的藥物提供理論依據(jù)。

研究表明IDH1在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)顯著上調(diào)，并存在于血漿中；IDH1可以作為診斷非小細(xì)胞肺癌的血清生物標(biāo)志物，具有較高的靈敏度和特異度[14]。本研究結(jié)果表明，IDH1與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展有關(guān)，并可能作為早期診斷的生物標(biāo)志物。α-KG是IDH1酶活性的重要產(chǎn)物，在IDH1誘導(dǎo)的信號(hào)通路中發(fā)揮多種作用。腫瘤進(jìn)展的內(nèi)在特征之一是α-KG水平的波動(dòng)，它可能通過觸發(fā)選擇性壓力下的生物能量變化來(lái)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。TET1蛋白是α-KG依賴的雙加氧酶，它可以催化5-mC轉(zhuǎn)化為5-hmC，是DNA去甲基化過程中一種重要的酶，對(duì)于維持干細(xì)胞的多能性有重要作用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多研究發(fā)現(xiàn)TET1可以增加基因組5-hmC的表達(dá)來(lái)抑制多種癌癥的發(fā)生或進(jìn)展，因此國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為TET1是一種抑癌基因[15]。TET1對(duì)5-hmC的調(diào)控在子宮內(nèi)膜癌及其他癌癥中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)TET1與子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展相關(guān)，并且可以作為判斷子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素[16-17]。轉(zhuǎn)染IDH1質(zhì)粒后，TET1在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的表達(dá)增強(qiáng)。Nrf2與多種疾病及腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，如白血病、肺癌、胰腺癌和腦腫瘤，Nrf2能調(diào)控其下游靶基因的表達(dá)水平，這些靶基因參與多種腫瘤耐藥。在子宮內(nèi)膜癌治療中，孕激素抵抗與轉(zhuǎn)錄因子Nrf2密切相關(guān)，Nrf2高表達(dá)促進(jìn)孕激素耐藥的發(fā)生，而下調(diào)Nrf2可增加子宮內(nèi)膜癌對(duì)孕激素的反應(yīng)性[18]。

Yu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Brusatol可通過調(diào)節(jié)不同信號(hào)通路，如Akt/mTOR/Nrf2等信號(hào)通路，對(duì)非小細(xì)胞肺癌、腸癌、乳腺癌等發(fā)揮抗腫瘤作用，改善化療耐藥性或放療耐藥性。孫翟等[20]研究表明目前子宮內(nèi)膜癌保守治療最佳的策略是大劑量的孕激素治療，而對(duì)孕激素的敏感性及是否產(chǎn)生耐藥是影響最終治療效果的關(guān)鍵因素。本研究Western blot檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)Brusatol和MPA抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞IDH1-α-KG-TET1-Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的Brusatol和孕激素均能抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，聯(lián)合使用Brusatol和孕激素對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用更強(qiáng)。Bai等[5]研究發(fā)現(xiàn)全面了解IDH1-α-KG-TE1-Nrf2信號(hào)傳導(dǎo)通路可能為預(yù)防子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展提供新的治療線索。本研究Dot blot檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Nrf2或IDH1或α-KG均提高了TET1催化5-hmC水平，而Brusatol抑制TET1的5-hmC，這說明Brusatol可通過去羥甲基化修飾抑制IDH1-α-KGTET1-Nrf2信號(hào)通路提高子宮內(nèi)膜癌對(duì)孕激素治療的敏感性、緩解孕激素抵抗。Xiang等[21]研究表明，在裸鼠胰腺癌模型中，Brusatol可通過抑制Nrf2途徑并增加活性氧的積累，顯著抑制裸鼠胰腺腫瘤的生長(zhǎng)。本研究也發(fā)現(xiàn)，接種Ishikawa細(xì)胞的裸鼠經(jīng)Brusatol處理后腫瘤生長(zhǎng)減慢，支持Brusatol能抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，同時(shí)聯(lián)合使用Brusatol和MPA可增強(qiáng)子宮內(nèi)膜癌對(duì)孕激素治療的敏感性、逆轉(zhuǎn)孕激素耐藥。

綜上所述，Brusatol可通過下調(diào)IDH1-α-KGTET1-Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)逆轉(zhuǎn)Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌的孕激素耐藥性。這為臨床合理開展孕激素治療子宮內(nèi)膜癌及尋求逆轉(zhuǎn)孕激素耐藥的藥物提供了理論參考。