胃癌組織神經元再生相關蛋白的表達及臨床意義研究

徐園 賈黎華 虞偉明

胃癌是常見的實體惡性腫瘤之一，已成為全球第五大最常見惡性腫瘤和第三大惡性腫瘤相關死亡原因[1-3]。盡管近年來臨床在胃癌診斷和治療方面取得了較大進展，但其仍然是一種死亡率極高和預后不良的疾病[4]。根治性手術切除是胃癌的重要治療方法。然而，由于胃癌缺乏早期特異性癥狀，多數患者被診斷時已是晚期，失去了手術治療的最佳時機。另外，在接受根治性手術切除的胃癌患者中，腫瘤復發和轉移也常發生。為了改善胃癌患者的預后，在過去的幾十年里，世界范圍內已經嘗試了多種治療方法，包括化療、放療、靶向治療等，但效果并不理想[5-6]。探尋胃癌新的生物標志物或治療靶點意義重大。神經元再生相關蛋白（neuronal regeneration associated protein, NREP），又稱C5orf13或P311，是一種高度保守的8 kDa胞內蛋白，含有68個氨基酸[7-8]。研究表明，NREP在胚胎、小鼠大腦中高表達，可參與細胞增殖、遷移和分化等多種生物學功能[9-10]。且NREP在惡性腫瘤進展中發揮重要作用，包括膠質母細胞瘤[11]、前列腺癌[12]、食管癌[13]等。然而NREP在胃癌中的研究報道不多。基于此，本研究旨在探討NREP在胃癌中的表達情況，并分析其臨床意義。通過挖掘不同公共在線生物信息數據庫的數據，探討NREP在胃癌組織中的表達情況，并應用基因芯片和免疫組化方法驗證其表達情況，分析NREP表達的臨床意義，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 研究標本 選取2021年3月至8月在寧波市李惠利醫院接受D2根治術的胃癌患者20例，術前均未接受放化療。其中男12例，女8例；年齡18～85歲，平均年齡56歲。留取患者胃癌組織和對應的癌旁正常組織作為研究標本。本研究經醫院醫學倫理委員會批準（批件號：KY2021PJ122），患者家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 在線生物信息數據分析胃癌組織NREP mRNA的表達 使用3個不同在線生物信息數據庫分析NREP mRNA在胃癌中的表達情況。（1）使用Oncomine數據庫（http://www.oncomine.org），其為公共在線癌癥微陣列數據庫和數據挖掘平臺。本研究閾值如下：P=0.01；差異倍數=2.0；數據類型：mRNA；范圍：前10%的基因。（2）使用基因表達譜交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）數據庫，其為中國學者設計的一個Web服務器，基于癌癥基因組圖譜計劃（The Cancer Genome Atlas Program,TCGA）和基因型組織表達數據庫（Genotype-Tissue Expression,GTEx）中的9 736個腫瘤樣本和8 587個正常樣本。（3）使用Ualcan數據庫（http://ualcan.path.uab.edu.），其為一個綜合的計算工具，使用3級RNA測序和從TCGA數據庫中的31種癌癥類型中提取的臨床病理參數，用于分析癌癥轉錄組數據。基于UCSC Xena數據庫分析胃癌患者預后不良的危險因素。Kaplan-Meier plotter數據庫分析胃癌患者NREP mRNA表達與預后的關系。

1.3 基因芯片分析胃癌組織差異表達基因 使用Trizol試劑提取20例患者的胃癌組織與癌旁正常組織的總RNA，操作參照試劑說明書進行。使用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0基因芯片（美國昂飛公司）確定基因表達譜。雜交后，對芯片進行清洗和染色。然后，使用Gene Chip Scanner 3000基因芯片掃描儀對微陣列進行掃描。采用MAS 5.0算法和Gene Spring 11.0軟件（美國安捷倫技術公司）進行數據讀取和分析。差異表達基因經微陣列顯著性分析篩選。上調和下調基因的閾值設置采用≥2或≤0.5倍的變化。

1.4 人類蛋白質圖譜（Human Protein Altas,HPA）分析胃癌組織NREP蛋白的表達 HPA（https://www.Proteinatlas.org/）是一個免費的公共生物信息數據庫，包括蛋白質的差異表達分析和對大約20種惡性腫瘤的免疫染色，可用于分析靶基因的蛋白表達。本研究通過HPA數據庫分析胃癌組織NREP蛋白的表達水平，并分析NREP在胃癌組織和正常組織中的免疫組化結果。

1.5 免疫組化檢測胃癌組織和癌旁正常組織NREP蛋白的表達 從石蠟包埋的胃癌組織、癌旁正常組織標本中分別切取5 μm薄切片，脫蠟并提取抗原。組織切片用兔多克隆NREP抗體（英國Abcam公司，1∶200稀釋）在4℃過夜，然后用生物素化的二抗孵育，并用二氨基聯苯胺（DAB）染色（丹麥Dako公司）。染色以細胞質或細胞膜呈棕黃色為陽性，由2名病理科醫生根據染色深度及染色細胞百分比進行評定，采用雙盲及統一標準。不染色為0分，染色淡為1分，染色中度為2分，染色深為3分。染色細胞百分比≤5%為0分，6%～30%為1分，31%～60%為2分，≥60%為3分。將每張切片的染色深度與染色細胞百分比得分相乘，其乘積為最后得分。0～1分為（-），2～3分為（+），4～6分為（++），＞6分為（+++）。將（-）及（+）設定為NREP蛋白低表達，（++）及（+++）設定為NREP蛋白高表達。

1.6 胃癌患者預后不良的危險因素分析 從UCSC Xena數據庫[14]下載患者生物信息，其為一個癌癥基因組數據庫，可為公共數據提供可視化分析。臨床參數包括患者性別、年齡、T期、N期、M期、病理分期和組織學分級，采用單因素和多因素分析胃癌患者預后不良的危險因素，以評估NREP蛋白表達對胃癌患者預后的預測價值。

1.7 Kaplan-Meier plotter數據庫分析胃癌患者NREP mRNA表達與預后的關系 Kaplan Meier-plotter是一種基于GEO、TCGA和Cancer Biomedical Informatics Grid（caBIG）的網絡服務器，用于評估各種基因對生存信息的影響。本研究通過Kaplan-Meier plotter數據庫分析胃癌患者NREP mRNA表達與預后的關系。

1.8 NREP功能的富集分析 采用基因本體（Gene Ontology,GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析方法研究NREP可能影響胃癌的生物學功能和信號通路，通過Pearson相關分析尋找與NREP表達相關的基因（|r|≥0.4，P＜0.05）。采用R軟件包對共表達基因進行功能分析。

1.9 統計學處理 采用GraphPad Prism 5統計軟件。非正態分布的計量資料組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料組間比較采用Fisher確切概率法。危險因素分析采用Cox比例風險模型。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，兩組生存曲線的比較采用logrank檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織與癌旁正常組織NREP mRNA表達水平比較 來自Oncomine數據庫的（Chen數據集）分析均顯示，胃癌組織NREP mRNA表達水平高于癌旁正常組織（P＜0.05），見圖1a。GEPIA數據庫分析顯示，胃癌組織NREP mRNA表達水平明顯高于癌旁正常組織（P＜0.05），見圖1b。Ualcan數據庫分析顯示，胃癌組織NREP mRNA表達水平高于癌旁正常組織（P＜0.05），見圖1c。

圖1 胃癌組織與癌旁正常組織NREP mRNA表達水平比較（a：Oncomine數據庫；b：GEPIA數據庫；c：Ualcan數據庫）

2.2 基因芯片檢測胃癌組織NREP mRNA表達結果基因芯片微陣列表達譜分析發現NREP mRNA在胃癌組織中高表達，胃癌組織中NREP mRNA的表達水平比癌旁正常組織高至少2.8倍，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 基因芯片檢測胃癌組織部分呈現異常高表達的基因

2.3 胃癌組織和癌旁正常組織NREP蛋白表達情況比較 通過HPA數據庫分析NREP在胃癌中的蛋白表達水平，顯示NREP在胃癌組織中高表達，呈中、高胞質胞膜染色（圖2a，見插頁）。20例胃癌患者的免疫組化檢測結果顯示，NREP在胃癌組織中細胞質或胞膜呈棕色強染色（圖2b，見插頁），即高表達，正常組織中呈低染色或不染色（圖2c，見插頁），即低表達；胃癌組織NREP蛋白高表達13例（65%），低表達7例（35%）；癌旁正常組織中NREP高表達4例（20%），低表達16例（80%），胃癌組織NREP蛋白高表達比例高于癌旁正常組織（P＜0.05）。

圖2 胃癌組織和癌旁正常組織NREP蛋白表達情況比較（a：基于HPA數據庫的NREP在胃癌組織中的表達情況，免疫組化染色，×100；b：NREP在胃癌組織細胞質或細胞膜中呈陽性染色，DAB染色，×200；c：NREP在癌旁正常組織中呈陰性染色，DAB染色，×400）

2.4 胃癌患者預后不良的危險因素分析 單因素分析顯示，年齡＞65歲、病理分期Ⅲ/Ⅳ期、T分期高、N分期高、M分期高及NREP高表達是胃癌患者預后不良的危險因素（均P＜0.05）。多因素分析顯示，年齡＞65歲、M分期高、NREP高表達是胃癌患者預后不良的獨立危險因素（均P＜0.05），見表2。

表2 胃癌患者預后不良的危險因素分析

2.5 胃癌患者NREP mRNA表達與預后的關系分析Kaplan-Meier plotter數據庫分析顯示，NREP mRNA低表達胃癌患者總生存時間、無進展生存時間均優于高表達胃癌患者（均P＜0.05），見圖3（插頁）。

圖3 胃癌患者NREP mRNA高表達與低表達患者生存曲線比較（a：總生存曲線比較；b：無進展生存曲線比較）

2.6 NREP基因功能富集分析結果 GO富集分析顯示，NREP基因編碼蛋白質主要定位于含膠原的細胞外基質、內質網腔、細胞外基質成分膠原三聚體、基底膜。這些蛋白主要參與細胞外結構組建、細胞外基質組建、成骨、細胞底物黏附和結締組織發育。KEGG通路分析顯示NREP主要富集于細胞外基質受體的相互作用、黏著斑、PI3K-Akt信號通路、人乳頭瘤病毒感染和細胞骨架作用調控等方面，見圖4。

圖4 NREP基因功能富集分析結果（a：在生物過程、細胞成分和分子功能等方面的GO富集分析；b：KEGG通路分析）

3 討論

由于缺乏早期診斷方法和腫瘤的強侵襲性，胃癌已成為全世界最致命的惡性腫瘤之一，其發病率仍居高不下。尋求新型的功能性生物標志物來幫助早期診斷和預測預后顯得尤為重要。在生物信息學工具和數據庫的幫助下，本研究探索了新的早期診斷生物標志物，并試圖研究其參與胃癌發生和發展的潛在分子機制。

NREP最初研究報道其主要存在于神經元和肌肉中[15]。現有關NREP的研究在逐漸增多，已有多項研究表明，NREP可參與促進神經和肺組織再生[16-17]、腎纖維化[18]、皮膚創傷血管生成[19]、肌成纖維細胞分化和遷移。此外，NREP在腫瘤中的作用和發揮的功能也引起了諸多學者的關注。

Mariani等[11]研究發現NREP在膠質細胞瘤中高表達，具有促進膠質母細胞瘤發展的作用。McDonough等[20]則進一步研究了NREP促進膠質瘤發生、發展的可能機制，認為NREP高表達可能通過激活Rac1，調節細胞遷移，進而影響細胞外周肌動蛋白，引起細胞骨架重構，在調節膠質瘤的運動和侵襲方面發揮了重要作用。唐春蘭等[21]發現NREP在肺小細胞癌中呈現過表達，且NREP與ITGB4BP存在相互作用，NREP可能通過NREP-ITGB4BP信號通路調節小細胞肺癌的遷移，從而參與肺癌的侵襲和轉移。

在本研究中，GEPIA、Oncomine和Ualcan等在線數據庫均顯示NREP mRNA在胃癌中呈高表達。此外，我們利用基因芯片、免疫組化等方法也驗證了NREP在胃癌中的表達水平。KM-Plotter和GEPIA數據庫顯示NREP高表達與胃癌的總生存時間和無進展生存時間不良密切相關。基于TCGA的原始數據，多因素Cox回歸分析顯示NREP是胃癌患者預后的獨立預測因子之一。據此，筆者推測NREP或可作為評價胃癌預后的生物標志物。

在腫瘤發生、發展過程中，包括胃癌在內，腫瘤細胞必須與外基質緊密結合，并與其他細胞溝通，形成適合增殖并最終轉移的間質微環境[22-23]。GO富集分析表明，NREP編碼的蛋白質主要定位于含膠原的細胞外基質、內質網腔、基底膜等處。這些蛋白在細胞外結構組織形成、細胞外基質組建、細胞底物黏附和結締組織的發育中發揮了重要作用，它們還參與膠原結合、整合素結合、糖胺聚糖結合和形成具有抗拉強度的細胞外基質結構成分，在腫瘤細胞增殖過程中提供了良好的間質微環境，并為腫瘤細胞最終發生侵襲，轉移提供條件。

KEGG通路分析顯示NREP主要富集于細胞外基質受體相互作用、局灶黏附、PI3K-Akt信號通路、人乳頭瘤病毒感染和細胞骨架作用調控等。近年來研究發現局灶黏附與細胞外基質受體相互作用是胃癌發生發展的重要途徑[24]。局灶黏附是一種細胞底物黏附結構，在整合素介導的信號轉導通路中發揮功能作用[25]。局灶性黏附與細胞外基質受體相互作用與整合素有關，這是一種異質二聚體細胞表面受體，參與細胞與細胞之間的特異性相互作用和細胞與細胞外基質的黏附。由此筆者推測，NREP可能為胃癌形成并最終轉移提供了良好的間質微環境，并可能通過調控腫瘤黏附與ECM受體的相互作用，參與胃癌的發生、發展。

綜上所述，NREP在胃癌組織中高表達，且其高表達與患者預后不良密切相關。NREP或參與了胃癌的發生、發展，可作為胃癌診斷和治療的新靶點。