基于生物信息學分析E74樣轉錄因子3在卵巢漿液性囊腺癌中的表達及作用機制

崔涵 張春雷 劉文珍

卵巢癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。卵巢癌患者手術治療后易復發且生存率較低[1]，臨床缺乏高靈敏度、高特異度的卵巢癌生物標志物[2]。卵巢漿液性囊腺癌是卵巢癌最常見的病理類型，其病因尚未完全明確，治療方案也有待臨床進一步探索[3]。E74樣轉錄因子3（E74-like transcription factor 3,ELF3）是上皮特異性轉錄因子之一，其遺傳改變和表達失調與多種上皮癌的進展有關[4]。目前，ELF3在卵巢漿液性囊腺癌中的研究報道少見。基于此，本研究采用生物信息學分析癌癥基因組圖譜數據庫（The Cancer Genome Atlas,TCGA）中的卵巢漿液性囊腺癌樣本數據，并將結果在基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus,GEO）中進行驗證，探討ELF3在卵巢漿液性囊腺癌中的表達情況，并分析其對卵巢漿液性囊腺癌診斷、預后評估的臨床價值及可能的作用機制，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 數據和樣本來源 提取TCGA中2006至2021年內收錄的且具有臨床信息數據的379例卵巢漿液性囊腺癌組織樣本和88例正常卵巢組織樣本的臨床信息和ELF3表達數據，選取TPM格式的RNAseq數據并進行log2轉化后進行樣本間的表達比較。獲取GEO的GSE38666數據集中12例患者正常卵巢上皮細胞及18例患者卵巢漿液性囊腺癌上皮細胞的測序結果進行ELF3 mRNA表達水平驗證，利用RMA方法對測序結果進行標準化。免疫組化結果來源于人類蛋白圖譜數據庫（The Human Protein Atlas,HPA）。本研究所用數據均為公共數據庫數據，符合醫學倫理。

1.2 生物信息學分析 采用R 3.6.3軟件對TCGA、GEO數據庫中組織樣本及細胞測序結果中基因表達情況進行統計分析與可視化，并對差異表達基因進行基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA），探索可能的作用機制。GSEA分析中，顯著富集的閾值為錯誤發現率（false discovery rate,FDR）＜0.25且P＜0.05。

1.3 臨床信息分組 卵巢漿液性囊腺癌患者根據年齡分為≤60歲和＞60歲；根據國際婦產科協會（International Federation of Obstetrics and Gynecology,FIGO）等級分為Ⅰ～Ⅳ級；根據初始治療效果分為疾病進展（progressive disease,PD）、疾病穩定（stable disease,SD）、部分緩解（partial response,PR）、完全緩解（complete response,CR）；根據種族分為亞裔、非洲裔和白人；根據組織學分級分為G1～4，分別為高分化、中分化、低分化及未分化；根據腫瘤發生部位分為雙側、單側；根據血管侵犯情況分為否和是，根據淋巴結侵犯情況分為否和是，根據腫瘤殘留情況分為否和是；根據ELF3 mRNA中位表達水平，分為ELF3 mRNA高表達、低表達。

1.4 統計學處理 采用R 3.6.3統計軟件。非正態分布的計量資料比較采用Mann-WhitneyU檢驗；采用ROC曲線評估ELF3 mRNA表達水平對卵巢漿液性囊腺癌的診斷價值；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，兩組患者生存曲線的比較采用log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 卵巢漿液性囊腺癌患者臨床資料 納入本研究的卵巢漿液性囊腺癌患者樣本共379例，年齡51～68歲，中位年齡59歲，其中≤60歲208例（54.9%），＞60歲171例（45.1%）；FIGO Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級分別1例（0.3%）、23例（6.1%）、295例（77.8%）、57例（15.0%），3例（0.8%）不詳；初始治療效果PD、SD、PR、CR分別27例（7.1%）、22例（5.8%）、43例（11.3%）、216例（60.1%）例，71例（18.7%）不詳；亞裔、非洲裔和白人分別12例（3.2%）、25例（6.6%）、328例（86.5%），14例（3.7%）不詳；組織學分級G1、G2、G3、G4分別 1例（0.3%）、45例（11.9%）、322例（85.0%）、1例（0.3%），10例（2.5%）不詳；腫瘤發生部位單側、雙側分別102例（26.9%）、255例（67.3%），22例（5.8%）不詳；血管侵犯否和是分別41例（10.8%）、64例（16.9%），274例（72.3%）不詳；淋巴結侵犯否和是分別48例（12.7%）、101例（26.6%），230例（60.7%）不詳；腫瘤殘留否和是分別67例（17.7%）、268例（70.7%），44例（11.6%）不詳；總生存（overall survival,OS）例數和死亡例數分別147例（38.8%）、232例（61.2%）；疾病特異性生存（disease free survival,DSS）例數和非卵巢癌因素死亡例數分別154例（40.6%）、200例（52.8%），25例（6.6%）例不詳。

2.2 卵巢漿液性囊腺癌組織與正常卵巢組織、卵巢漿液性囊腺癌上皮細胞與正常卵巢上皮細胞ELF3表達情況比較 卵巢漿液性囊腺癌組織ELF3 mRNA表達水平高于正常卵巢組織（P＜0.05），見圖1a（插頁）。卵巢漿液性囊腺癌上皮細胞ELF3 mRNA表達水平高于正常卵巢上皮細胞（P＜0.05），見圖1b（插頁）。卵巢漿液性囊腺癌組織中ELF3蛋白表達陽性，正常卵巢組織中表達陰性，見圖1c、d（插頁）。

圖1 卵巢漿液性囊腺癌組織與正常卵巢組織、卵巢漿液性囊腺癌上皮細胞與正常卵巢上皮細胞ELF3表達情況比較（a：卵巢漿液性囊腺癌組織與正常卵巢組織ELF3 mRNA表達水平比較；b：卵巢漿液性囊腺癌上皮細胞與正常卵巢上皮細胞ELF3 mRNA表達水平比較；c：卵巢漿液性囊腺癌組織ELF3蛋白表達陽性，免疫組化染色，×40；d：正常卵巢組織ELF3蛋白表達陰性，HE染色，×40）

2.3 不同臨床病理特征患者卵巢漿液性囊腺癌組織ELF3 mRNA表達水平比較 不同FIGO等級、初始治療效果、種族、組織學分級、腫瘤發生部位、血管侵犯、腫瘤殘留的患者卵巢漿液性囊腺癌組織ELF3 mRNA表達水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），年齡＞60歲的患者卵巢漿液性囊腺癌組織ELF3 mRNA表達水平低于年齡≤60歲的患者（P＜0.05），見圖2。

圖2 不同臨床病理特征患者卵巢漿液性囊腺癌組織ELF3 mRNA表達水平比較（a：不同FIGO級別；b：不同病理分級；c：不同人種；d：不同年齡；e：是否侵犯淋巴結；f：是否侵犯血管；g：是否腫瘤殘留；h：不同腫瘤發生部位；i：不同初始治療效果）

2.4 ELF3 mRNA表達水平對卵巢漿液性囊腺癌的診斷價值分析 ELF3 mRNA表達水平診斷卵巢漿液性囊腺癌的ROC曲線顯示AUC為0.988，最佳截斷值為4.450，靈敏度為0.988，特異度為0.977，見圖3。

圖3 ELF3 mRNA表達水平診斷卵巢漿液性囊腺癌的ROC曲線

2.5 ELF3 mRNA高表達與低表達患者預后比較ELF3 mRNA低表達患者OS和DSS均優于低表達患者，差異有統計學意義（均P＜0.05），見圖4。

圖4 ELF3 mRNA高表達與低表達患者總生存曲線和疾病特異性生存曲線比較（a：總生存曲線；b：疾病特異性生存曲線）

2.6 ELF3在卵巢漿液性囊腺癌中可能參與的信號通路 GSEA富集分析結果顯示，ELF3 mRNA表達相關的基因可能參與G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptors,GPCR）與配體結合（標準化富集分數=-1.420，FDR=0.023，P＜0.05）和神經元系統（標準化富集分數=-1.463，FDR=0.023，P＜0.05）兩條信號通路。

3 討論

ELF3的表達情況在多種腫瘤疾病中可作為預后預測指標。例如，ELF3高表達與結腸癌的不良預后有關[5]，其mRNA是人表皮生長因子受體2陽性乳腺癌的不良預后的指標，并且作為癌基因發揮作用[6]，上皮細胞特異性轉錄因子1（epithelial cell-specific transcription factor 1,ESE1）/ELF3和NF-κB的一致上調也預示著前列腺癌患者的不良預后[7]。同時，ELF3也參與調控多種腫瘤疾病的進程。在非小細胞肺癌中，過表達的ELF3通過PI3K/Akt和ERK信號通路促進腫瘤細胞的增殖和轉移[8]；在結腸癌中，ELF3激活Wnt/β-catenin信號通路，促進疾病進展[3]；在膽道癌中，ELF3直接抑制E盒結合鋅指蛋白2并上調扣帶蛋白的表達，ELF3的丟失導致細胞間連接減少和細胞運動性增強，促進腫瘤的進展，花生四烯酸5-脂氧合酶和CXC趨化因子配體16也是ELF3的直接靶標，在免疫反應中發揮調節作用[9]；Yachida等[10]對60例壺腹癌組織進行了全外顯子組測序和DNA拷貝數分析，并進行了靶向測序，結果表明ELF3是壺腹癌的驅動因素；ESE1/ELF3與NF-κB亞基p65和p50相互作用，通過增強其核易位和轉錄活性以及誘導p50轉錄而驅動前列腺癌的進展[7]。說明ELF3是腫瘤疾病進程調節的重要因素，同時也是診斷和預后的潛在分子標志物。但ELF3在卵巢癌中的研究較為缺乏，基于以上原因，本研究對其在卵巢漿液性囊腺癌中的診斷、預后評估價值及可能參與的作用機制進行了探索。

本研究結果顯示，ELF3 mRNA在卵巢漿液性囊腺癌組織中表達水平明顯高于正常卵巢組織，說明ELF3 mRNA具有作為診斷卵巢漿液性囊腺癌的分子標志物的潛能，ROC曲線顯示AUC為0.988，說明ELF3可以很好的區分腫瘤組織與正常組織，有望成為卵巢癌的生物標志物。分析患者臨床病理特征與ELF3 mRNA表達水平的關系，發現年齡＞60歲的患者卵巢漿液性囊腺癌組織ELF3 mRNA表達水平低于年齡≤60歲的患者，這說明ELF3 mRNA高表達在年輕患者患病因素中可能更加重要。另外，ELF3 mRNA高表達患者較低表達患者預后差。

ELF3蛋白在卵巢漿液性囊腺癌組織中高表達，說明其可能參與該疾病的發生、發展，對此，本研究GSEA富集分析卵巢漿液性囊腺癌組織中ELF3表達相關的基因，結果顯示ELF3可能參與GPCR配體結合和神經元系統兩條信號通路，其中GPCR可以感應細胞外的分子并激活內部信號轉導途徑，最終激活細胞反應。已有多項研究表明GPCR參與的信號通路參與癌癥的疾病進程[11-13]，尤其是在卵巢癌中，GPCR通過鈣離子信號通路促進腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉移[14]。那么ELF3是如何參與GPCR信號通路，在這個過程中GPCR又是通過何種途徑促進卵巢癌的進展，值得臨床進一步探討。結合并激活GPCR配體包括光敏化合物、氣味、信息素、激素和神經遞質等[15]，而ELF3相關基因也參與神經元系統信號通路。在卵巢漿液性囊腺癌中是否通過調節神經元系統來調控GPCR信號通路也值得臨床進一步探討。

綜上所述，ELF3 mRNA表達水平在卵巢漿液性囊腺癌中具有較高的診斷、預后評估價值，高表達患者預后較差，并可能通過GPCR配體結合和神經元系統兩條信號通路發揮作用。