加味香連丸對急性放射性腸炎大鼠NF-κB信號通路的影響*

蘇景陽 傅 越 王夢蕾 嚴 江 王 玨 林勝友

（浙江中醫藥大學附屬杭州市中醫院，浙江 杭州 310007）

放射性腸炎多為腹腔、盆腔及腹膜后惡性腫瘤予以放射線治療后所引起的并發癥，其發病機制與Toll樣受體（TLRs）[1]亞型中的TLR-4[2]所下調的核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路產生的腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）在內的多種炎癥因子有關。腸道黏膜炎癥損傷后表現為受累組織黏膜炎癥水腫、壞死，甚至組織纖維化。林勝友名醫工作室主要開展中醫藥抗腫瘤復發、轉移，放化療增效減毒的臨床及基礎研究。林勝友教授為浙江省名中醫，強調放射線歸屬于“火熱毒邪”，自擬放射性腸炎經驗方——加味香連丸，由炒川連、廣木香、紅藤、蒲公英、敗醬草、馬齒莧6味藥組成，治以清熱解毒、澀腸止瀉，在放射性腸炎患者的治療中取得了顯著療效，明顯提高了患者生活質量。為進一步研究加味香連丸治療放射性腸炎的作用機制，本團隊制備急性放射性腸炎大鼠模型進行實驗，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠40只，2月齡，體質量（200±20）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK（滬）2018-0006。每籠飼養5只，SPF飼料喂養，實驗期間大鼠自由飲用蒸餾水，室溫恒定26℃，相對濕度60%～70%，光照為12 h明暗交替。適應性喂養5 d，定期觀察大鼠外形、體形、行動、有無異常損傷等。

1.2 實驗藥物 加味香連丸，組方：炒川連6 g，廣木香 9 g，紅藤 15 g，蒲公英 15 g，敗醬草 15 g，馬齒莧30 g。藥材煎汁、過濾，濃縮至100%濃度，置4℃冰箱備用。思密達，博福一益普生（天津）制藥有限公司，國藥準字H20000690，規格：3 g×10袋。

1.3 試劑及儀器 試劑：TLR-4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α試劑盒（福建省泉州市睿信生物科技有限公司）。儀器：醫用直線加速器（瓦里安），光學顯微鏡（Nikon），恒溫生化培養箱（博迅），冷凍高速離心機（美國Thermo），多功能酶標儀（美國Thermo），洗板機（美國Bio-Rad），移液器（德國，Eppendorf）。

1.4 模型制備 40只大鼠禁食12 h后，隨機選取10只設為正常組，腹腔注射3%戊巴比妥1.5 mL/kg全麻后固定于有機玻璃板上，除正常組外，其余3組大鼠予直線加速器12-MV的X射線單次照射全腹部，腹部給予1 cm組織補償，調整準直器光柵大小，上達劍突下，下至恥骨聯合，范圍大約5 cm×8 cm，源皮距100 cm，劑量率 200 cGy/min[3]。

1.5 分組與給藥 照射后12 h，將大鼠隨機分為模型組、加味香連丸組、思密達組，各10只。正常組、模型組予5 mL/kg生理鹽水灌胃；加味香連丸組按照60 kg成人-動物實驗藥效比例表換算大鼠灌胃劑量。思密達組根據黃繼漢等[4]藥理實驗中動物與人體間的等效劑量換算，由標準體質量到非標準體質量的公式為Db′=Da·Rab·Sb，按大鼠實際體質量算出所需思密達劑量并制成思密達混合液，每1 mL含0.283 g思密達，按0.283 g/kg灌胃。各組灌胃量均為5 mL/kg，每日1次，持續5 d。

1.6 標本采集與檢測 1）觀察各組大鼠一般狀況，包括精神狀態、飲食進水、毛色、反應靈敏程度、排便情況、體質量變化等。正常大鼠糞便為棕褐色，粒狀；腹瀉表現為含不消化食物、黏液樣便、黃綠色稀水樣便、膿血便等。精神狀態、飲食進水、排便情況分為好、較好、一般、較差、很差，分別對應0分、1分、2分、3分和4分，評分越高，一般情況越差[5]。2）實驗記錄至大鼠大量死亡當天，剩余大鼠予CO2處死。在嚴格無菌條件下迅速打開腹腔，取出空腸中段及回盲部近端回腸中段組織后用10%甲醛固定液固定48 h，二甲苯脫脂，酒精脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，觀察并記錄各組大鼠腸組織病理改變。光鏡下評估絨毛水腫程度，絨毛疏密度、高矮、脫落情況，隱窩結構，炎性細胞浸潤，組織出血及潰瘍等情況。按Chiu標準[6]對各組腸黏膜損傷分為6級。3）另取部分空腸、回腸組織用預冷的0.9%NaCl溶液沖洗干凈后配置組織勻漿，根據TLR-4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α試劑盒（酶聯免疫分析法）說明書配置試劑進行檢測，記錄實驗結果并分析數據。

1.7 統計學處理 采用2019版EXCEL匯總數據，SPSS23.0軟件進行數據分析。采用獨立樣本T檢驗進行兩兩比較分析，結果以（）表示。P＜0.05為差異存在統計學意義，P＜0.01為差異有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠形態學改變 見表1，表2。造模后大鼠精神狀態較前萎靡，造模當晚模型組死亡1只；照射后第1天思密達組死亡1只，除正常組外各組大鼠飲食量減少，精神較前萎靡，大便成形。第2天大鼠體質量減輕，模型組大鼠可見水樣便，加味香連丸、思密達組大鼠大便尚成形。照射后第3天模型組大鼠死亡2只，3組大鼠體質量持續性降低，反應遲鈍，精神萎靡膽怯，成群蜷縮抱團，各組大鼠均出現水樣便，模型組最明顯。照射后第4天大鼠死亡12只（模型組5只、加味香連丸組4只、思密達組3只），大鼠均出現水樣便，部分大鼠甚至出現膿血便，直腸脫垂，不欲飲食，體質量明顯降低，呈嗜睡瀕死狀態。照射后第5天思密達組大鼠死亡4只，剩余大鼠極度萎靡，停止實驗。放射后3組大鼠體質量、癥狀評分較正常組差異有統計學意義（P＜0.05），加味香連丸組與思密達組體質量差異無統計學意義（P＞0.05），癥狀評分存在明顯差異（P＜0.05）。

表1 各組急性放射性腸炎大鼠體質量比較（g，±s）

表1 各組急性放射性腸炎大鼠體質量比較（g，±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組 別n 照射后第0天 照射后第1天 照射后第2天 照射后第3天 照射后第4天正常組模型組加味香連丸組思密達組10 10 10 10 254.12±4.54 254.62±5.72 250.60±10.60 253.11±5.30 255.40±4.70 245.67±4.87*238.50±8.42*242.00±4.03*257.00±4.97 233.33±6.28*230.50±6.45*233.78±4.55*265.50±7.91 210.89±15.14*207.20±10.00*207.44±5.61*272.30±8.76 191.00±5.67*192.50±4.18*194.60±3.51*

表2 各組急性放射性腸炎大鼠癥狀評分比較（分，±s）

表2 各組急性放射性腸炎大鼠癥狀評分比較（分，±s）

組 別n 照射后第0天 照射后第1天 照射后第2天 照射后第3天 照射后第4天正常組模型組加味香連丸組思密達組10 10 10 10 0 0 0 0 0 1.00±0.47*0.30±0.48*△0.44±0.53*△0 2.11±0.60*1.00±0.47*△1.22±0.67*△0 3.00±0.82*2.10±0.86*△2.56±0.88*0 3.50±0.71*2.83±0.75*3.00±0.63*

2.2 各組急性放射性腸炎大鼠大體解剖觀察結果見圖1。模型組、加味香連丸組及思密達組大鼠均可見胃內容物堆積、胃擴張，3組大鼠腸道組織較正常組增粗水腫、淤血青紫，其中模型組腸道組織青紫最明顯，加味香連丸組表現相對較輕。

圖1 大鼠大體解剖觀察結果

2.3 各組急性放射性腸炎大鼠腸組織病理結果 見圖2，圖3。根據Chiu標準[6]進行分級：正常組絨毛密集、高度相似，無脫落情況，隱窩結構正常，組織無出血及潰瘍，評為0級；模型組絨毛脫落、腺體萎縮明顯，回腸部分可見固有層消化崩解，點狀出血及壞死，淋巴組織增生，肌層、漿膜層破壞缺失，評為5級；加味香連丸組絨毛結構尚存，絨毛脫落變鈍，部分血管暴露，評為4級；思密達組絨毛破壞明顯，隱窩結構異常，淋巴組織增生顯著，固有層消化崩解，可見點狀出血，評為5級。

圖2 各組大鼠回腸組織病理學觀察（HE染色，100倍）

圖3 各組大鼠空腸組織病理學觀察（HE染色，100倍）

2.4 各組大鼠小腸組織 TLR-4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α含量比較 見表3，表4。加味香連丸組急性放射性腸炎大鼠腸組織TLR-4、NF-κBp65含量及相關炎癥因子IL-6、TNF-α含量較正常組無明顯差異（P＞0.05），加味香連丸組各項指標較思密達組無明顯差異（P＞0.05）。

表3 各組急性放射性腸炎大鼠腸組織TLR-4、NF-κB p65含量比較（pg/mL，±s）

表3 各組急性放射性腸炎大鼠腸組織TLR-4、NF-κB p65含量比較（pg/mL，±s）

組別n TLR-4回腸 空腸NF-κB p65回腸 空腸10正常組模型組加味香連丸組思密達組2 6 2 545.57±29.86 509.71±10.01 518.29±17.00 505.06±9.47 506.13±21.70 510.30±11.34 504.57±20.15 540.85±44.84 38.02±1.59 37.34±0.31 36.49±1.94 36.87±0.39 36.16±1.72 36.79±1.31 34.69±1.56 36.56±0.85

表4 各組急性放射性腸炎大鼠腸組織炎癥因子含量比較（pg/mL，±s）

表4 各組急性放射性腸炎大鼠腸組織炎癥因子含量比較（pg/mL，±s）

組別n正常組模型組加味香連丸組思密達組10 2 6 2 IL-6回腸31.77±1.45 32.24±0.06 31.81±1.19 31.48±0.40空腸30.77±0.98 32.53±0.86 31.14±1.41 31.60±0.27 TNF-α回腸65.27±2.91 67.45±0.94 66.15±2.09 65.10±2.88空腸63.01±2.27 67.34±1.79 65.67±3.43 65.85±3.45

3 討論

加味香連丸組TLR-4、NF-κBp65及相關炎癥因子IL-6、TNF-α含量與正常組比較未見明顯差異（P＞0.05），提示加味香連丸對NF-κB信號通路有一定影響，可能存在抗炎效果。惡性腫瘤多為“癌毒”內生所致[7-8]，放射線為火熱毒邪，火毒外侵，直接損傷腸道，導致腸道清濁不分，傳化失司，故大便稀溏或如水樣，次數增多，腹脹腹痛。放射性腸炎急性期邪氣亢盛，以祛邪為要。加味香連丸方中黃連清熱燥濕，瀉火解毒；木香辛行苦降，善行大腸之滯氣；紅藤善治腸癰，清熱活血；蒲公英、敗醬草、馬齒莧清熱消腫排膿。本方以清熱解毒，祛濕止瀉為主，能夠有效針對放射性腸炎熱毒外侵的發病機制。西醫學認為電離輻射能促使過量的活性氧（ROS）和活性氮（RNS）產生從而誘導以NF-κB為核心的信號通路啟動，促使TNF-α、IL-6等相關炎癥因子釋放，加重腸道黏膜炎癥損傷。因此，急性放射性腸炎可以通過阿米福汀清除ROS減少炎癥所致相關不良反應[9]、口服益生菌制劑促進黏膜成纖維細胞釋放環氧合酶介導的前列腺素E2維持黏膜上皮完整性和耐受性[10]及健康人群菌群移植調節腸道菌群[11]等治療。

Fiorino等[12]臨床研究表明，小腸受照劑量≥5 Gy時，隨著放射劑量的增加，不良反應逐漸增加，當放射劑量＞50 Gy時，可并發急性放射性腸炎。積極調控不同部位放射線劑量有利于減少相關并發癥的發生。Chopra等[13]人員進行的一項多因素研究中表示約束V15＜250 cc、V30＜100 cc以及V40＜90 cc可使大腸三級毒性由26.7%降至5.4%。Mouttet-Aldouard等[14]臨床也發現乙狀結腸V30～40 Gy與“消化道毒性”顯著相關（P＜0.006）。Smeenk等[15]則通過限制肛周不同肌肉照射放射劑量改善括約肌緊張度，同時降低大小便失禁的發生率。調強適形放療因靶區精確劑量治療以提高臨床療效并減少周圍器官并發癥而被推廣開來。模型組、思密達組大鼠突然大量死亡考慮與放射線劑量過大、沒有調強適形放療有關，且與徐偉等[3]文獻報道的12 Gy是最佳造模劑量有所差異，表明單次放射線最佳劑量選定仍需進一步證實。加味香連丸組大鼠癥狀改善不明顯考慮與大劑量放射線超過個體可調節閾值、導致個體無法耐受致使免疫系統損害有關。加味香連丸組大鼠大體解剖及病理組織損害相對模型組及思密達組大鼠較輕，TLR-4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α相關指標含量與正常組比較未見明顯差異（P＞0.05），可見加味香連丸能影響急性放射性腸炎大鼠NF-κB信號通路的炎癥指標，起到一定的保護治療作用，但加味香連丸組大鼠相關檢驗指標與思密達組比較未見明顯差異（P＞0.05），考慮可能與最終存活的大鼠耐受性較高或檢驗指標改善晚于臨床有關，還需進一步延長實驗周期加以證明。實驗動物還可選用不同大鼠，如SD、Wistar大鼠[16]進行研究，不同品種大鼠差異性尚未比較，存在一定局限性。本研究以60 kg成人體質量為標準治療劑量，給藥劑量是由林教授臨床不斷積累經驗后得出的結論，以此標準通過動物實驗藥效比例表換算成大鼠灌胃的劑量，初步對比加味香連丸湯劑與常用西藥思密達對放射性腸炎的治療效果，但后期仍需增設不同濃度劑量組別進行比較。此外后期應建立腫瘤相關大鼠放射性腸炎動物模型模擬人體腫瘤微環境，增設不同放射劑量、不同品種大鼠進行實驗，增加常用中藥組與加味香連丸進行比較以證實加味香連丸療效，突顯藥物特色；檢測指標應更加全面，進一步探查并確定加味香連丸相關藥物成分與NF-κB信號通路上相關位點及檢測指標的關系。