電場處理對普魯蘭酶水解糯米淀粉的影響

陳彩雯 田佳寧 于坤正 李丹丹

(1. 南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2. 濟寧賽寶工業信息技術研究院，山東 濟寧 272000)

淀粉，除了作為人類和動物的食物之外，絕大部分通過酶法或化學法轉化為淀粉水解物、葡萄糖漿、果糖糖漿和麥芽糊精等高附加值產品[1-2]。工業上使用的淀粉原料多數是支鏈淀粉與直鏈淀粉的混合物，其中支鏈淀粉含量一般在75%～85%。直鏈淀粉是主要由α-1,4-糖苷鍵形成的線性聚合物，支鏈淀粉則由約95%的α-1,4-糖苷鍵和約5%的α-1,6-糖苷鍵形成的多分支結構構成[3]。因此，為了徹底水解淀粉，通常需要多種淀粉酶的協同作用。其中，葡萄糖淀粉酶既能水解α-1,4-糖苷鍵又能水解α-1,6-糖苷鍵，但其水解α-1,6-糖苷鍵的速率較慢，從而造成淀粉質原料利用率及產品品質的下降。而普魯蘭酶能夠專一性地切開支鏈淀粉中的α-1,6-糖苷鍵，加速α-1,6-糖苷鍵的水解，實現原料利用率的提高及產品品質的改善[4-5]。因此，普魯蘭酶逐漸成為淀粉加工中不可或缺的關鍵酶制劑，被廣泛應用在淀粉糖加工、改性淀粉、醫藥、飼料、啤酒及白酒釀造等工業中，尤其是作為淀粉加工中的非大宗關鍵酶制劑，在工業應用方面有重大價值及大量需求[6-7]。

電場作為食品處理的常用物理方式，可以改善淀粉的理化性質和微觀結構，作為淀粉常壓干法改性的方法，具有重要的工業應用潛力[8]。同時，其特有的電學特性在淀粉改性和酶活性調控方面表現出了高適應現象[9]。Samaranayake等[10]發現，60 ℃條件下1 V/cm電場處理后，α-淀粉酶活性可增加41%。Durham等[11]發現，30 ℃條件下，8～12 V/cm電場處理后，纖維素的酶解速率常數可增加49%～164%。Ohshima等[12]發現，與傳統水浴加熱相比，低強度脈沖電場在相同加熱速率時，可提高酶活性5%～20%。與菌株篩選、基因工程菌株構建等復雜方法相比，電場處理具有操作簡單、容易實現的優點。然而現有研究中，未見關于電場處理對普魯蘭酶活力影響的報道，其作用機制不明。研究擬以糯米淀粉為原料，通過掃描電子顯微鏡、X-射線衍射儀、差示掃描量熱儀和快速黏度儀等技術對電場作用下糯米淀粉酶解效率、酶解淀粉的顆粒形貌、結晶性質和熱特性等進行研究，并在此基礎上探究電場處理對普魯蘭酶活力(不加淀粉)以及淀粉結構性質(不加酶)的影響，從而解析電場影響普魯蘭酶水解糯米淀粉的機制，為電場技術在淀粉酶法改性領域的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米淀粉：食品級，淀粉含量95%以上，其中支鏈淀粉含量達98%，安徽蚌埠市兄弟糧油食品有限公司；

普魯蘭酶：1 U/mg，上海源葉生物試劑有限公司；

DNS試劑：分析純，上海源葉生物試劑有限公司；

醋酸、醋酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

單相輸出500VA變頻電源：KHD-1100型，寧波凱華德電子科技有限公司；

紫外可見分光光度計：HP 33120A型，南京菲勒儀器有限公司；

掃描電子顯微鏡：EVO-LS10型，德國卡爾·蔡司股份有限公司；

X射線衍射儀：D2 PHASER型，美國Bruker儀器公司；

差氏掃描量熱儀：Q20型，美國TA儀器公司；

快速黏度分析儀：RVA 4500型，澳大利亞Perten公司；

冷凍干燥機：FreeZone型，美國Lanconco公司；

高速離心機：GL-20G-H型，上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 電場處理對普魯蘭酶水解糯米淀粉的影響 利用乙酸鈉緩沖液(0.04 mol/L，pH 4.4)配制0.06 g/mL的普魯蘭酶溶液，并取20 mL加入2.0 g糯米淀粉，磁力攪拌30 s，50 ℃恒溫水浴，插入電極片(電極尺寸10 mm×10 mm×2 mm)，打開交變電源(正弦)進行電場處理：電場強度分別為0.0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5 V/cm；電場頻率50 Hz；處理時間20 min。處理后，加入2 mol/L NaOH溶液調整pH至11.0滅酶，再加入2 mol/L HCl溶液中和。3 500 r/min離心10 min，所得沉淀物經80%乙醇洗滌3次(每次100 mL)，凍干備用；利用DNS法測定上清液中還原糖含量。

1.3.2 電場處理對普魯蘭酶活力的影響(不加淀粉) 利用乙酸鈉緩沖液(0.04 mol/L，pH 4.4)配制0.06 g/mL的普魯蘭酶溶液，并取20 mL，50 ℃恒溫水浴，電場強度分別為0.0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5 V/cm；電場頻率50 Hz；處理時間20 min，測定酶活力。

1.3.3 電場處理對淀粉結構性質的影響(不加酶) 準確稱取2.0 g糯米淀粉于20 mL乙酸鈉緩沖液(0.04 mol/L，pH 4.4)中，混勻，50 ℃恒溫水浴，電場強度分別為0.0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5 V/cm；電場頻率50 Hz；處理時間20 min，3 500 r/min離心10 min。所得沉淀物經80%乙醇洗滌3次(每次100 mL)，凍干備用。

1.3.4 還原糖含量測定 采用DNS法[13]。

1.3.5 酶活力測定 參照龍杰[5]的方法。

1.3.6 掃描電鏡觀察(SEM) 用牙簽將淀粉及其酶解產物均勻分散至雙面導電膠帶上(雙面導電膠帶固定于載物臺上)，用洗耳球吹去粘結不牢的粉末，真空噴金，觀察淀粉及其酶解產物的表面形態(加速電壓5 000 V，放大倍數5 000)。

1.3.7 X-射線衍射分析(XRD) 參照Li等[14]的方法。Cu Kα輻射，管壓40 kV，管流40 mA，掃描速度4 (°)/min，掃描范圍(2θ)4°～40°，步長0.028，接受狹縫0.2 mm。利用MDI Jade 6.5軟件分析譜圖，分析結晶晶型并按式(1)計算相對結晶度。

(1)

式中：

Rc——相對結晶度，%；

Ac——結晶區含量，%；

Aa——無定形區含量，%。

1.3.8 差示掃描量熱分析(DSC) 參照Li等[15]的方法。

1.3.9 快速黏度分析(RVA) 參照AACC 76-21。

1.4 數據處理

所有試驗重復3次取平均值。采用Origin 8.6軟件繪圖，SPSS 21.0軟件進行顯著性分析。P<0.05代表差異顯著。

2 結果與分析

2.1 電場處理對普魯蘭酶水解糯米淀粉的影響

由圖1可知，當電場強度為0.0～2.5 V/cm時，還原糖含量從0.50 g/L增加至0.53 g/L；但之后隨著電場強度的進一步增加，還原糖含量逐漸降低；當電場強度為5.0，7.5 V/cm時，還原糖含量大于空白對照組，當電場強度為10.0，12.5 V/cm時，還原糖含量低于空白對照組。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 電場強度對還原糖含量的影響Figure 1 Effect of the intensity of the electric field on the content of reducing sugar

研究[9,12]表明，低強度電場處理可改善酶活性，酶活性的增加可降低反應的活化能，有利于酶促反應的進行；而高強度電場處理會嚴重破壞酶分子的結構，使酶鈍化。Barba等[16]發現，只有電場強度達到臨界值(Ec)才可引起蛋白分子的極化：低強度作用下，蛋白分子沿著電場方向有序排列，但其結構變化較小；中強度電場可誘導蛋白分子極化，其內部的疏水基團外露；但隨著電場強度進一步增加，極化蛋白分子間通過疏水相互作用絡合，與試驗結果高度契合。

2.2 電場輔助酶解對淀粉顆粒結構的影響

由圖2可知，天然糯米淀粉顆粒形狀不規則，大部分顆粒尺寸為4～5 μm，與Li等[17]的結果一致。經普魯蘭酶處理后，淀粉顆粒表面出現孔洞或裂縫，部分大顆粒被降解為小的片段，且小的片段間可能發生粘附。當電場強度為0.0 V/cm時，淀粉顆粒表面處有許多的裂縫和孔洞；當電場強度為2.5 V/cm時，由于酶解程度的增加，淀粉顆粒破壞增加，小的碎片發生聚集，形成了大顆粒；隨著電場強度的進一步增加，淀粉酶解程度降低，淀粉表面依然存在裂縫和孔洞，但數目和尺寸減少。淀粉顆粒表面孔洞數目和尺寸的增加，將極大地提高淀粉的比表面積，有利于運載功能性成分和用作吸附劑[18-19]。低電場強度時，淀粉表面會出現孔洞和裂縫，酶解產物可用作多孔淀粉；而高電場強度時，淀粉顆粒結構被完全破壞，產物不能用作吸附劑使用[17]。當電場強度為12.5 V/cm時，淀粉依然維持原有的顆粒結構，但表面孔洞和裂縫增加，是由于試驗溫度固定為50 ℃，消除了電場熱效應影響的緣故[20]。

圖2 電場輔助酶解對糯米淀粉掃描電鏡圖像的影響Figure 2 Effect of the electro-assisted hydrolysis on the SEM image of waxy rice starch

2.3 電場輔助酶解對淀粉結晶結構的影響

由圖3可知，原糯米淀粉在15.02°，17.02°，18.08°，23.08°處出現衍射峰，屬于典型的A型淀粉，與Li等[17]的結果一致。電場輔助酶解后，糯米淀粉的結晶晶型未發生顯著變化，但酶解淀粉的相對結晶度均高于原糯米淀粉。隨著電場強度從0.0 V/cm增加至2.5 V/cm，糯米淀粉的相對結晶度從42.39%增加至49.66%；但隨著電場強度的進一步增加，相對結晶度逐漸降低。淀粉顆粒是由疏松的無定形層和致密的結晶層交替排列形成的半剛性結構。在酶解過程中，酶分子優先水解疏松的無定形層，從而導致淀粉相對結晶度增加。Han等[21-23]發現，電場處理可破壞淀粉的顆粒和半結晶結構，從而造成淀粉相對結晶度降低。

圖3 電場輔助酶解對糯米淀粉X-射線衍射圖譜和相對結晶度的影響Figure 3 Effect of the electro-assisted hydrolysis on the XRD pattern and relative crystallinity of waxy rice starch

2.4 電場輔助酶解對淀粉熱特性的影響

由圖4可知，原糯米淀粉的DSC曲線上出現了兩個吸熱峰，第一個顯著的吸熱峰為支鏈淀粉熔融峰，第二個較微弱的吸熱峰則歸因于熱穩定的直鏈淀粉—脂質復合物的熔化。一般情況下，淀粉相對結晶度增加代表淀粉結構有序性增加，破壞其結構所需要的能量會增加，體現在DSC曲線上即為糊化溫度和焓值的增加。Abdorreza等[24]報道，西米淀粉的糊化溫度和焓值隨酸解程度的增加而增加。由表1可知，隨著電場強度的增加，糯米淀粉的To、Tp逐漸增加，但焓值變化不明顯。這可能是電場加快了非結晶區的酶解效率，對結晶區破壞較小，焓值不變而糊化溫度小幅度升高；其次，電場加快了支鏈部分的酶解，使直鏈淀粉比例增加，也會導致糊化溫度增加。此外，糯米淀粉中含有少量的直鏈淀粉，該直鏈淀粉可與脂肪形成脂質復合物，脂質復合物的熱穩定性較高，通常出現在80 ℃左右。隨著酶解的進行，第2個吸熱峰位置和焓值并未發生顯著變化，說明直鏈淀粉—脂質復合物的含量未發生明顯變化。

圖4 電場輔助酶解對糯米淀粉DSC曲線的影響Figure 4 Effect of the electro-assisted hydrolysis on the DSC curves of waxy rice starch

表1 電場輔助酶解對糯米淀粉DSC參數的影響?Table 1 Effect of the electro-assisted hydrolysis on the DSCparameters of waxy rice starch

2.5 電場輔助酶解對淀粉糊化特性的影響

由圖5和表2可知，淀粉酶解后，淀粉顆粒表面被破壞，吸水膨脹能力受限，淀粉糊的峰值黏度、谷值黏度、崩解值和最終黏度均降低。酶解程度越大，黏度降低越多。經2.5 V/cm電場輔助酶解后，淀粉糊黏度下降最多，峰值黏度從原淀粉的1 852 mPa·s降低至1 153 mPa·s，崩解值從616 mPa·s降低至324 mPa·s；而經12.5 V/cm電場處理后，淀粉糊黏度僅降低了126 mPa·s，崩解值減少了292 mPa·s，與還原糖結果一致。Polesi等[25]和Ahmed等[26]研究發現，隨著水解程度的增加，淀粉糊黏度逐漸降低。淀粉回生值主要與直鏈淀粉的泄露及重新聚集有關。研究[27]表明，淀粉的改性會導致淀粉分子排列的規整性降低。酶解淀粉的回生值均低于原淀粉，是由于普魯蘭酶水解α-1，6-糖苷鍵，切除支鏈后的淀粉分子排列規整性降低，原本的有序結構受到影響，直鏈淀粉重新締合的速率減慢，回生值減小，與劉程玲等[28]的結果相似。同時，淀粉損傷程度的增加將會導致淀粉糊化溫度的降低[29]。與原糯米淀粉相比，酶解淀粉的糊化溫度略有上升，可能與酶解過程中優先水解無定形層導致的淀粉相對結晶度增加有關。

表2 電場輔助酶解對糯米淀粉RVA參數的影響?Table 2 Effect of the electro-assisted hydrolysis on the RVAparameters of waxy rice starch

圖5 電場輔助酶解對糯米淀粉RVA曲線的影響Figure 5 Effect of the electro-assisted hydrolysis on the RVA curves of waxy rice starch

2.6 電場影響普魯蘭酶水解糯米淀粉的可能機制

由圖6(a)可知，當電場強度從0.0 V/cm增加到5.0 V/cm時，相對酶活性從100%增加到116%；但隨著電場強度的進一步增加，普魯蘭酶活性迅速降低。電場作用下，普魯蘭酶活性的變化趨勢與淀粉酶解效率一致，說明試驗條件下，酶活性的變化可能是導致淀粉酶解效率變化的主導因素。然而，在利用電場強化α-淀粉酶水

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖6 電場影響普魯蘭酶水解糯米淀粉的可能機制Figure 6 Possible mechanism of the electro-assisted hydrolysis of waxy rice starch in the presence of pullulanase

解玉米淀粉的試驗中，電場對淀粉酶解效率的影響與α-淀粉酶活力的變化趨勢并不一致，而淀粉結構變化對電場強化淀粉酶解效率的影響極為顯著[17]。這可能是由于前期試驗條件中，未控制電場處理的溫度且緩沖液濃度較高(0.2 mol/L)，隨著電場強度和處理時間的增加，淀粉酶解液的溫度逐漸上升，淀粉顆粒結構被部分破壞，淀粉分子從顆粒內部泄露，與淀粉酶間的親和力增加。而該試驗中，處理溫度控制在50 ℃且緩沖液濃度低(0.04 mol/L)，電場熱效應可忽略。

淀粉顆粒和結晶結構的微小破損即可顯著影響淀粉的吸水膨脹，從而導致淀粉糊黏度的降低。為了進一步明確電場對普魯蘭酶水解糯米淀粉的作用機理，測定了電場作用下淀粉的糊化性質變化(不加普魯蘭酶)。由圖6(b)可知，不同電場處理后，淀粉的糊化曲線近乎重疊，證實電場處理并未能對糊化結構性質造成顯著影響。因此，試驗條件下，電場作用下淀粉結構性質變化可能并非是影響普魯蘭酶水解糯米淀粉效率的關鍵因素。但值得注意的是，由于電場擁有物質所具有的力和能量的客觀屬性，會對處于其中的物質產生力及能量的作用[30]。因此，電場作用于酶解反應時，可能會賦予淀粉酶解中間產物(碳正離子)反應基團動能，使官能團中的原子和電荷活躍度更高，更易參加反應。

3 結論

探究了不同強度電場作用下糯米淀粉水解效率、普魯蘭酶活力、糯米淀粉結構性質的變化規律。結果表明，強度≤2.5 V/cm的電場可改善普魯蘭酶的活力，從而加速糯米淀粉的酶解速率；強度≥5 V/cm的電場則導致酶活力的降低，酶解效率降低。隨著酶解的進行，淀粉顆粒表面逐漸出現孔洞、裂縫、破裂及小片段的聚集等現象。電場輔助酶解不會改變淀粉的結晶晶型，但相對結晶度增加；且酶解程度越高，相對結晶度越大。電場輔助酶解后，糯米淀粉第1個糊化峰的起始溫度增加，但第2個糊化峰的起始溫度以及糊化焓均未發生顯著變化。淀粉的峰值黏度、谷值黏度、終點黏度、崩解值和回生值經酶解后均顯著降低，且酶解程度越高，黏度下降越多。試驗條件下，電場對淀粉結構性質的影響不顯著，說明電場對普魯蘭酶水解糯米淀粉的作用主要與酶活力的變化相關。而對于電場處理影響普魯蘭酶活性的原因尚不清楚，還需進一步研究。