艾草黃酮提取工藝優化及抗氧化活性研究

王 娜 張昊宇 寧燦燦 范允濤 王林青 余秋穎

(1. 河南農業大學食品科學技術學院，河南 鄭州 450002；2. 鄭州市營養與健康食品重點實驗室，河南 鄭州 450002；3. 農業農村部大宗糧食加工重點實驗室，河南 鄭州 450002；4. 北京豐森源林業科技有限公司，北京 102100；5. 鄭州師范學院分子生物學重點實驗室，河南 鄭州 450044)

艾草(Artemisiaargyi)，又稱艾蒿、香艾、冰臺等，為菊科多年生草本植物[1]，在中國已有2 000余年藥食兩用歷史。艾草主要化學成分包括揮發油類、黃酮類、三萜類、多糖以及微量元素[2-4]等。黃酮類物質是艾草主要成分，天然植物中黃酮類物質抗炎特性目前已有報道，黃酮類物質作為有效的抗氧化劑，能夠清除機體內的各類自由基并抑制其形成[5-7]。

常見的艾草總黃酮傳統提取工藝包括加壓溶劑法、浸提法、索氏抽提法等，但是艾草總黃酮得率相對較低(提取率≤6%)，且提取時間較長[8-10]。近年來利用微波、超聲波及超聲—微波協同提取艾草活性物質的研究已有報道[11-13]，但多數研究僅關注艾草總黃酮得率，并未同時考察艾草黃酮抗氧化活性。研究擬以艾草總黃酮得率和抗氧化活性為考察指標，優化艾草黃酮的提取工藝條件以期為艾草黃酮進一步的應用研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

艾草：品種宛艾(一年貯存期內)，產地北京延慶，水分含量25%；

蘆丁標準品：純度≥95.0%，北京索萊寶科技有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)標準品：純度≥97.0%，福州飛凈生物科技有限公司；

無水乙醇：分析純，天津富宇精細化工有限公司；

亞硝酸鈉、硝酸鋁、硫酸亞鐵、水楊酸：分析純，天津市大茂化學試劑廠；

30%過氧化氫溶液：分析純，煙臺市雙雙化工有限公司。

1.2 儀器與設備

雙光束紫外可見分光光度計：TU-1901型，北京普析通用儀器有限責任公司；

微孔板分光光度計：BioTek/epoc型，美國BioTek instruments公司；

微波光波超聲波萃取儀：Sientz-IIDM型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

高速多功能粉碎機：HC-200T型，武義海納電器有限公司；

臺式低速離心機：TD-5A型，湖南赫西離心機儀器有限公司；

電子分析天平：FA1204型，寧波力辰科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘆丁標準曲線繪制 取蘆丁標準品10 mg，置于50 mL容量瓶中，使用60%乙醇定容得到0.2 mg/mL的蘆丁標準品溶液，分別取0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL蘆丁標準品溶液于10 mL具塞試管中，按照亞硝酸鈉—硝酸鋁—氫氧化鈉法顯色后使用60%乙醇定容至10 mL，參照文獻[14]進行線性關系考察，以蘆丁濃度(c)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程：A=12.666c+0.009 5，R2=0.999 2，在蘆丁標準品濃度0.00～0.05 mg/mL范圍內線性關系良好。

1.3.2 艾草黃酮提取方法選擇

(1) 超聲—微波輔助水提：參考王琴等[15]的方法，稍作修改。干艾草10.0 g，粉碎30 s，按m干艾草∶V水=1∶30 (g/mL)加去離子水，混勻，60 ℃水浴處理40 min后將料液置于微波光波超聲波萃取儀中，設置超聲功率460 W、超聲時間30 min、微波功率600 W、微波時間120 s，提取后將料液過濾，5 000 r/min離心10 min取上清液，得到艾草黃酮提取液。

(2) 超聲—微波輔助醇提：干艾草10.0 g，粉碎30 s，按m干艾草∶V乙醇=1∶30 (g/mL)加入體積分數60%的乙醇溶液，混勻，將樣品置于微波光波超聲波萃取儀中，設置超聲功率460 W、超聲時間30 min、微波功率600 W、微波時間120 s，提取后將料液過濾，5 000 r/min離心10 min 取上清液，得到艾草黃酮提取液[13]。

(3) 傳統煎煮：參考朱瑜等[16]的方法，稍作修改。干艾草10.0 g，粉碎30 s，按m干艾草∶V水=1∶30 (g/mL)加去離子水，混勻，將料液煮沸10 min后過濾，濾渣加入相同比例的水進行二次煎煮，合并濾液，5 000 r/min離心10 min，得到艾草黃酮提取液。

(4) 水浴加熱提取：參考鄭云展等[17]的方法，稍作修改。干艾草10.0 g，粉碎30 s，按m干艾草∶V水=1∶30 (g/mL)加去離子水，混勻，95 ℃水浴處理120 min后將料液過濾，5 000 r/min離心10 min，得到艾草黃酮提取液。

1.3.3 單因素試驗設計 由于試驗所用微波光波超聲波萃取儀處于恒溫模式的儀器無法恒定微波功率和工作時間，同時恒溫模式控溫不精準。故提取過程中不對溫度進行控制，艾草總黃酮提取液在提取結束后的溫度約為70～75 ℃。

(1) 超聲時間：取樣品10.0 g，固定超聲功率340 W，微波時間120 s，微波功率600 W，料液比1∶30 (g/mL)，考察超聲時間(20，25，30，35，40 min)對艾草總黃酮得率及抗氧化活性的影響。

(2) 超聲功率：取樣品10.0 g，固定超聲時間30 min，微波時間120 s，微波功率600 W，料液比1∶30 (g/mL)，考察超聲功率(220，280，340，400，460 W)對艾草總黃酮得率及抗氧化活性的影響。

(3) 微波時間：取樣品10.0 g，固定超聲時間30 min，超聲功率340 W，微波功率600 W，料液比1∶30 (g/mL)，考察微波時間(60，90，120，150，180 s)對艾草總黃酮得率及抗氧化活性的影響。

(4) 微波功率：取樣品10.0 g，固定超聲時間30 min，超聲功率340 W，微波時間120 s，料液比1∶30 (g/mL)，考察微波功率(300，400，500，600，700 W)對艾草總黃酮得率及抗氧化活性的影響。

(5) 料液比：取樣品10.0 g，固定超聲時間30 min，超聲功率340 W，微波時間120 s，微波功率600 W，考察料液比[1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 (g/mL)]對艾草總黃酮得率及抗氧化活性的影響。

1.3.4 Plackett-Burman試驗設計 以單因素試驗設計為基礎，將超聲時間、超聲功率、微波時間、微波功率和料液比5個試驗因素分別設置高、低2個水平，以艾草總黃酮得率為響應值，共設計12組試驗，篩選出對艾草總黃酮得率影響較高的因素進行響應面試驗。

1.3.5 響應面試驗設計 以超聲功率、超聲時間和料液比3個對響應值影響顯著的因素為自身變量，以艾草總黃酮提取率為響應值，利用Design-Expert 12.0軟件進行響應面試驗設計。

1.3.6 艾草總黃酮得率測定 采用紫外分光光度法[14]測定總黃酮含量，按式(1)計算艾草總黃酮得率。

(1)

式中：

Y——艾草總黃酮得率，mg/g；

c——供試品溶液的艾草總黃酮濃度，mg/mL；

n——稀釋倍率；

V——艾草提取液體積，mL；

m——艾草質量，g。

1.3.7 抗氧化活性指標的測定

(1) 艾草總黃酮清除DPPH自由基能力：參考文獻[18]，按式(2)計算DPPH自由基清除率。

(2)

式中：

Q——DPPH自由基清除率，%；

Ai——2 mL樣品溶液+ 2 mL 0.1 mol/L DPPH溶液的吸光度；

Aj——2 mL樣品溶液+ 2 mL無水乙醇的吸光度；

Ac——2 mL無水乙醇+ 2 mL 0.1 mol/L DPPH溶液的吸光度。

(2) 艾草總黃酮清除羥自由基能力：參考文獻[19]，按式(2)計算羥自由基清除率。

(3)

式中：

Q——羥自由基清除率，%；

A1——2 mL 9 mmol/L FeSO4溶液+2 mL 9 mmol/L水楊酸—乙醇+2 mL 9 mmol/L H2O2+2 mL樣品溶液的吸光度；

A2——2 mL 9 mmol/L FeSO4溶液+2 mL 9 mmol/L水楊酸—乙醇+2 mL樣品溶液的吸光度；

A0——2 mL 9 mmol/L FeSO4溶液+2 mL 9 mmol/L水楊酸—乙醇+2 mL 9 mmol/L H2O2吸光度。

1.4 統計分析

采用SPSS 22.0進行方差分析；Design-Expert 12.0進行響應面試驗設計和結果分析。

2 結果與分析

2.1 艾草總黃酮提取方法選擇

預試驗發現，超聲提取法艾草總黃酮得率47.90 mg/g，DPPH自由基清除率79.81%，羥自由基清除率61.65%；微波提取法艾草總黃酮得率為42.53 mg/g，DPPH自由基清除率78.52%，羥自由基清除率53.64%，兩種提取方法的得率明顯偏低，抗氧化活性方面優勢不明顯，故篩選艾草總黃酮提取方法時未將上述兩種提取方法納入比較。

由表1可知，各提取方法間艾草總黃酮得率有顯著性差異(P<0.05)，傳統煎煮法的艾草總黃酮得率最高，超聲—微波輔助水提法次之；水浴加熱提取法的DPPH自由基清除率最高，但與超聲—微波輔助水提法差異不顯著；超聲—微波輔助水提法的OH自由基清除率最高，且與其他方法差異顯著(P<0.05)。由于傳統煎煮法與水浴加熱提取法耗時較長，同時綜合考慮黃酮得率及抗氧化活性，確定超聲—微波輔助水提法作為艾草總黃酮的理想提取方法，并優化其提取工藝。

表1 提取方法對總黃酮得率與抗氧化活性的影響?Table 1 Effects of different extraction methods on flavonoid yield and antioxidant activity

2.2 單因素試驗

2.2.1 超聲處理時間對總黃酮得率和抗氧化活性的影響

由表2可知，超聲時間30，40 min時艾草總黃酮得率和羥自由基清除率同其他組差異顯著(P<0.05)，超聲30 min 時DPPH自由基清除率最高且與其他組差異顯著(P<0.05)。綜合考慮，超聲時間選擇30 min。

表2 超聲時間對總黃酮得率和抗氧化活性的影響?Table 2 The effects of ultrasonic time on flavonoid yieldand antioxidant activity

2.2.2 超聲功率對總黃酮得率和抗氧化活性的影響 由表3可知，超聲功率340 W時艾草總黃酮得率最高，與其他組差異顯著(P<0.05)；超聲功率340，460 W的DPPH

表3 超聲功率對總黃酮得率和抗氧化活性的影響?Table 3 The effects of ultrasonic power on the yield and antioxidant activity

自由基清除率較高且二者差異不顯著。綜合考慮，超聲功率選擇340 W。

2.2.3 微波處理時間對總黃酮得率和抗氧化活性的影響

由表4可知，微波時間180 s時艾草總黃酮得率最高，微波時間120 s時次之。由于微波時間120 s時DPPH自由基與羥自由基清除率均最高，因此選擇微波時間120 s。

表4 微波處理時間對總黃酮得率和抗氧化活性的影響?Table 4 The effects of microwave treatment time on the yield and antioxidant activity

2.2.4 微波功率對總黃酮得率和抗氧化活性的影響 由表5可知，微波功率600 W時艾草總黃酮得率與DPPH自由基清除率最高，與其他組間差異顯著(P<0.05)。微波功率500，600 W的羥自由基清除率較高，且二者差異不顯著。綜合考慮，選擇微波功率600 W。

表5 微波功率對總黃酮得率和抗氧化活性的影響?Table 5 The effects of microwave power on the flavonoid yield and antioxidant activity

2.2.5 料液比對總黃酮得率和抗氧化活性的影響 由表6 可知，料液比1∶20 (g/mL)時艾草總黃酮得率最高，與其他各組間差異顯著(P<0.05)，料液比1∶30 (g/mL) 時次之。料液比1∶30 (g/mL)時DPPH自由基清除率和羥自由基清除率最高。綜合考慮，選擇料液比1∶30 (g/mL)。

表6 料液比對總黃酮得率和抗氧化活性的影響?Table 6 The effects of solid-liquid ratio on flavonoid yield and antioxidant activity

2.3 Plackett-Burman試驗

Plackett-Burman試驗設計及結果見表7、表8，試驗結果方差分析見表9。

表7 Plackett-Burman試驗設計Table 7 Experimental design of Plackett-Burman design

表8 Plackett-Burman試驗結果Table 8 Results of Plackett-Burman design

由表9可知，超聲時間、超聲功率和料液比3個因素對艾草總黃酮得率影響極顯著(P<0.01)，選擇以上3個因素進行響應面優化設計試驗。微波時間和微波功率兩個因素對艾草總黃酮提取影響較低，后續試驗中將其固定為120 s和600 W。

表9 Plackett-Burman 試驗結果方差分析表?Table 9 Analysis of variance of Plackett-Burman design

2.4 響應面優化試驗

2.4.1 試驗設計及結果 響應面試驗優化水平設計見表10。

表10 響應面試驗設計因素及水平表Table 10 Factors and levels of response surface design

利用Design-Expert 12.0對表11的數據進行方差分析和回歸分析，對試驗結果進行擬合。以超聲功率、超聲時間和料液比為自變量，擬合得到回歸方程：

表11 響應面試驗設計及結果Table 11 Experimental design and results of response surface design

Y=-549.88+3.08A+3.66B+4.12C-0.000 6AB+0.002 7AC+0.024BC-0.004 6A2-0.077B2-0.091C2。

(4)

表12 響應面試驗結果方差分析表?Table 12 Analysis of variance of response surface design

2.4.3 最佳工藝的修訂及驗證實驗 通過Design-Expert 12.0得到最佳提取工藝為：超聲功率339.83 W、超聲27.08 min、料液比1∶31.14 (g/mL)，艾草總黃酮得率達到最大值87.70 mg/g。考慮實際操作，工藝參數調整為：

料液比1∶30 (g/mL)、60 ℃水浴40 min、超聲功率340 W、超聲時間27 min、微波功率600 W、微波處理120 s，進行3組平行驗證實驗，其艾草總黃酮得率均值為87.93 mg/g，與預測值(87.70 mg/g)相差0.03%，相對標準偏差為0.61%，接近模型預測值，說明預測模型可靠。

2.5 最佳工藝與傳統煎煮、水浴熱提取的比較

由表13可知，試驗所得最佳提取工藝在艾草總黃酮得率和羥自由基清除率方面顯著優于傳統煎煮法、水浴加熱提取法。

表13 最佳工藝與傳統方法的艾草總黃酮得率與抗氧化活性比較?Table 13 Comparison of flavonoid yield and antioxidant activity between optimal process and traditional process

3 結論

以艾草總黃酮得率、DPPH自由基清除率、羥自由基清除率為指標，采用Plackett-Burman試驗及響應面試驗優化超聲—微波輔助水提工藝，結果表明，艾草黃酮的最佳提取工藝為60 ℃水浴40 min，超聲340 W處理27 min，微波600 W處理120 s，料液比1∶30 (g/mL)，此時艾草總黃酮得率可達87.93 mg/g，DPPH自由基清除率為80.84%，羥自由基清除率為77.92%，其艾草總黃酮得率和羥自由基清除率顯著優于傳統煎煮和水浴加熱法。試驗未進一步探究艾草黃酮物質組成及各組分生物活性，后續將以大孔樹脂純化艾草總黃酮后使用高效液相—質譜聯用法對艾草總黃酮純度以及組成成分等進行分析研究。