葛根降血壓茶的制備及對自發性高血壓大鼠的降壓作用

劉 璐 袁亞宏 岳田利,2

(1. 西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 咸陽 712100；2. 西北大學食品科學與工程學院，陜西 西安 710069)

除醫學藥物治療外，茶療法因人群飲用廣泛、購買便利，是預防與治療高血壓的一種很好的輔助方法[1]。從茯磚茶中分離出的冠突散囊菌(EurotiumCristatum)，也稱“金花菌”，可以與多種發酵原料相互作用，通過分泌微生物酶使發酵基質具有獨特的風味和口感[2-3]。在發酵過程中茶多酚被轉化成兒茶素衍生物、黃酮類化合物及其苷類、酚酸類、生物堿類和萜類等多種成分，具有抗高血壓、抗氧化、減輕體重、緩解代謝綜合征和調節腸道等功效[4]。

綠茶是世界上最受歡迎的飲料之一，含有豐富的生物活性物質，長期飲用綠茶和綠茶產品對人體健康有益，特別是對癌癥、心血管疾病和糖尿病人群[5]。研究[6]表明，綠茶對血管緊張素轉換酶(ACE)活性的抑制率比發酵生產的紅茶和黑茶要高，可能是多酚類等物質含量和性質發生了變化。目前，葛根提取物已被應用于臨床上的冠心病心絞痛、高血壓的治療，其對高鹽飲食誘導的小鼠有降壓作用[7]，且可改善L-NAME誘導的高血壓大鼠心肌肥大和血管內皮細胞腫脹等癥狀[8]。

研究擬利用冠突散囊菌發酵綠茶與葛根基質，以ACE酶活性的體外抑制率為評價指標，考察基質含水量、葛根添加量和冠突散囊菌孢子懸浮液接種量對ACE抑制活性的影響。同時闡述葛根降血壓茶在動物體內的生物利用度，探究將不同劑量的發酵茶液灌胃自發性高血壓大鼠(SHR)后對其血壓的影響，了解葛根降血壓茶在動物體內24 h內發揮的作用，為更好分析可能的降壓機制，從其中提取或開發出降血壓的新型茶類產品提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

葛根、卡托普利：市售；

綠茶：陜西省安康市圣泰生物科技有限責任公司；

冠突散囊菌：從湖南省益陽茶廠伏磚茶中分離，保存于西北農林科技大學健康食品制造與安全實驗室；

兔肺ACE、馬尿酰—組氨酰—亮酸(HHL，≥98%)、馬尿酸(Hip，98%)：西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；

冰乙酸(≥99.9%)、甲醇(≥99.9%)：色譜級，西安化學試劑廠；

硼酸、氯化鈉、濃鹽酸(36%)：分析純，西安化學試劑廠。

1.1.2 試驗動物

體重220～240 g，11周齡， 30只SPF級雄性自發性高血壓大鼠(SHR)， 6只雄性Wistar-Kyoto(WKY)大鼠，包括飼料和墊料，飼養于西北農林科技大學健康食品制造與安全實驗室，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀：LC-2030型，馬來西亞島津公司；

恒溫恒濕培養箱：MP160B型，上海福瑪實驗設備有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-ZK2型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

旋轉蒸發儀：YRE-501型，鄭州長城科工貿有限公司；

高速冷凍離心機：HC-3018R型，安徽中科中佳科學儀器有限公司；

超純水機：ULPHW-Ⅱ型，四川優普超純科技有限公司；

紅外水分測定儀：MA35M-1CN型，上海賽多利斯貿易有限公司；

智能無創血壓計：CODA-MNTR型，北京世聯博研科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冠突散囊菌孢子懸浮液的制備

(1) PDA培養基活化冠突散囊菌：稱取去皮的馬鈴薯 200 g，瓊脂20 g和葡萄糖20 g，量取1 000 mL蒸餾水。將新鮮購買的馬鈴薯去皮清洗干凈，并切成大小均一的塊狀放入合適的鍋中，將量好的蒸餾水倒入鍋中并在一定溫度下煮沸 20 min。涼至室溫后用8層紗布過濾，在濾液中加入稱好的葡萄糖和瓊脂，加熱溶解，并定容至1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

(2) 孢子懸浮液制備：將保藏在斜面上的分離純化的菌株接種至PDA培養基上，28 ℃恒溫恒濕培養箱培養5 d，無菌操作條件下，挑取菌絲轉接到新鮮的PDA培養基上進行活化，28 ℃恒溫恒濕培養箱培養5 d。無菌操作條件下，在PDA培養基上加入5 mL無菌生理鹽水，涂抹后全部倒入100 mL無菌生理鹽水進行稀釋，用血球計數板進行計數(0.5～2×105個/mL)，備用。

1.3.2 不同發酵程度的葛根茶制備 稱取20 g綠茶于滅菌鍋汽蒸，加入3 g葛根粉(葛根打碎，過60目篩)，采用超純水調整發酵基質含水量為25%，121 ℃滅菌鍋汽蒸15 min，冷卻后接種3%的冠突散囊菌孢子懸浮液，于28 ℃、78%濕度下分別培養5，7，9，11，13 d，取出后自然干燥5 h后備用。

1.3.3 單因素試驗

(1) 葛根添加量：按1.3.2進行發酵，發酵時間7 d，分別考察葛根添加量(1，2，3，4，5 g)對發酵茶ACE活性抑制率的影響。

(2) 基質含水量：按1.3.2進行發酵，發酵時間7 d，分別考察基質含水量(15%，20%，25%，30%，35%)對發酵茶ACE活性抑制率的影響。

(3) 孢子懸浮液接種量：按1.3.2進行發酵，發酵時間7 d，分別考察孢子懸浮液接種量(1%，2%，3%，4%，5%)對發酵茶ACE活性抑制率的影響。

1.3.4 正交優化試驗 結合單因素條件優化試驗結果，選取葛根添加量、含水量和孢子懸浮液接種量3個因素，設計L9(34)正交優化試驗，分析其對ACE酶活性體外抑制率的影響。

1.3.5 ACE活性抑制率測定

(1) 樣品提取：將發酵茶粉碎，過60目篩。以無水乙醇為提取媒介，按料液比1∶10 (g/mL)，常溫超聲(100 W，20 kHz)提取30 min，提取兩次，用旋轉蒸發儀將提取液減壓濃縮，得到乙醇浸膏，再將其溶于10 mL SSB(pH 8.3)，即得100 mg/mL的發酵茶提取物，4 ℃貯藏備用。

(2) 馬尿酸標準曲線的建立：取濃度為1.00 mmo/L的馬尿酸標樣，用超純水分別稀釋成0.01，0.05，0.10，0.50，1.00 mmo/L系列濃度，在最佳流動相和波長下用HPLC測定Hip的峰面積，Hip峰面積與濃度的線性關系為y=1 756.35x+101.56，R2=0.999 5。

(3) ACE活性抑制率測定：通過HPLC檢測馬尿酸峰面積來計算抑制ACE活性水平，并按式(1)計算ACE酶活性的體外抑制率。

R=(CA-CS)/(CA-C0)×100%，

(1)

式中：

R——體外抑制率，%；

CA——對照組馬尿酸濃度，mmol/L；

CS——樣品組馬尿酸濃度，mmol/L；

C0——空白對照組馬尿酸濃度，mmol/L。

HPLC檢測條件：檢測器SPD-M20A，Hypersil ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相A為0.1%冰乙酸水溶液，流動相B為甲醇溶液，流速0.8 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量10 μL，檢測波長228 nm。梯度洗脫步驟見表1。

表1 梯度洗脫表Table 1 Gradient elution procedure

1.3.6 試驗動物分組及劑量設置 飼養環境(25±1) ℃，相對濕度55%～65%，晝夜明暗交替，自主攝食和飲水，適應性喂養1周后進行灌胃試驗。將根據正交試驗優化得到的發酵茶打碎成粉，稱取6 g，加入100 mL 100 ℃蒸餾水，沸水浴加熱30 min，過濾，旋蒸，100 mL蒸餾水復溶，得到60 g/L的茶液提取物。每組大鼠按1 mL/100 g調整灌胃量。試驗前，隔天測定大鼠血壓，待穩定適應后開始記錄試驗。自發性高血壓大鼠給藥前血壓在適應性喂養后測量，間隔2 d后再次測量，重復3次取平均值為給藥前初始值。試驗組分別在給藥后的2，4，6，12，24 h測定自發性高血壓大鼠的收縮壓和舒張壓。

將30只SHR隨機分為5組(每組6只)：茶高、中、低劑量組、模型對照組和陽性對照組；12只WKY大鼠隨機分為2組(每組6只)：正常對照組、茶高劑量灌胃組。茶高劑量組(SHR-H)，600 mg/kg葛根降血壓茶液；茶中劑量組(SHR-M)，300 mg/kg葛根降血壓茶液；茶低劑量組(SHR-L)，150 mg/kg葛根降血壓茶液；模型對照組(SHR-NaCl)，相應劑量生理鹽水；陽性對照組(SHR-卡托普利)，卡托普利，根據人日用量通過體表面積換算得到劑量為1 mg/kg；正常高劑量組(WKY-H)，高劑量葛根降血壓茶液；正常對照組(WKY)，相應劑量生理鹽水。

1.3.7 數據處理 所有試驗重復3次取平均值，結果以均數±標準差表示，顯著性檢驗為T檢驗(P<0.05)，采用SPSS 20.0軟件進行統計處理，Excel 2016軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 發酵時間對ACE酶活性體外抑制率的影響

由圖1可知，整個發酵過程中，除發酵第9天的茶樣抑制率顯著降低外，其他發酵茶的ACE酶活性抑制率均高于未發酵的綠茶，且發酵第7天和第13天的抑制率較高，分別為74.68%和76.03%。第7天的發酵茶被賦予獨特的“金花菌”香，有豐富醇香的氣味且苦澀程度降低，與龔受基等[9]的結果類似。發酵同時還掩蓋了葛根的中藥味道和氣味，與張波等[10]的結論類似。發酵第13天的發酵茶存在明顯霉味，感官品質上遜色于第7天的回甘茶香，可能是由于綠茶基質中酚類及氨基酸類物質被生物轉化，且醇類化合物是發酵茶中產生花香和木香氣味的揮發性物質[11]。故選取第7天為發酵終止時間。

圖1 發酵過程中ACE酶活性的體外抑制率變化Figure 1 Changes in ACE-inhibitory rate during fermentation

2.2 各因素對葛根降壓茶ACE抑制率的影響

2.2.1 葛根添加量 由圖2可知，當葛根添加量為1 g時，ACE酶活性體外抑制率最高(75.43%)，當葛根添加量繼續增大時，ACE酶活性抑制率呈下降趨勢。當葛根添加量超過3 g時，發酵茶的ACE酶活性抑制率低于原始綠茶原料(70.11%)。在發酵基質中加入葛根是因為其活性物質，如葛根素可通過RAAS系統影響自發性高血壓大鼠的血壓，而ACE是經典RAAS過度激活的途徑之一[12]。發酵過程中，冠突散囊菌的代謝和生物轉化可使茶多酚類物質含量有不同程度的下降[9]，也可將葛根中的糖苷型異黃酮轉化為苷元型異黃酮[13]。ACE酶活性體外抑制率隨葛根添加量的增大而下降，可能是因為發酵基質中綠茶基質比例降低，或具降壓潛力的活性物質的成分和含量比例變化，不利于抑制ACE活性。研究[14]表明，葛根降血壓茶中大豆苷和染料木苷的含量與發酵過程中冠突散囊菌孢子數量、微生物酶活(多酚氧化酶等)和ACE抑制率呈反比，即葛根的添加，不利于發酵茶的降壓功效改善。故選擇葛根添加量為1～3 g。

圖2 葛根添加量對ACE抑制活性的影響Figure 2 Effects of pueraria addition on ACE- inhibitory rate

2.2.2 基質含水量 由圖3可知，從ACE酶活性體外抑制率來看，基質的最適含水量為20%～30%。ACE酶活性體外抑制率隨基質含水量的進一步增加而下降，且最優含水量明顯低于文獻[15]。這可能是因為微生物菌株的呼吸模式及生長代謝促使分泌的降解酶(如蛋白酶)適合的含水量不同[16]，致使代謝產物的生成受到影響，從而影響ACE酶活性抑制率。因此，通過對發酵基質含水量的控制，可以獲得較高的ACE酶活性抑制率。

圖3 基質含水量對ACE抑制活性的影響Figure 3 Effects of water content on ACE-inhibitory rate

2.2.3 孢子懸浮液接種量 由圖4可知，冠突散囊菌接種量與ACE酶活性體外抑制率呈正比，當孢子懸浮液接種量為5%時，ACE活性抑制率最高，表明冠突散囊菌決定了發酵成品中具有抑制ACE酶活的生物活性物質生成。有研究表明，在適當接種量范圍內，冠突散囊菌菌株大量生長繁殖，微生物降解酶如纖維素酶、多酚氧化酶活性會明顯增加[2]，釋放多種生物活性代謝物如類黃酮、茶多酚衍生物、生物堿等[17]，從而非競爭性抑制ACE活性。冠突散囊菌在發酵過程中分泌了多種酶，如多酚氧化酶、α-淀粉酶等，使基質中活性物質(茶多酚、生物堿等)含量發生變化，最終影響發酵茶的ACE抑制率[14]，說明選擇較大的接種量可以有效縮短發酵周期，且采用冠突散囊菌固態發酵是一種有效的創新工藝思路。故選擇孢子懸浮液接種量為3%～5%。

圖4 孢子懸浮液接種量對ACE抑制活性的影響Figure 4 Effects of spore suspension volume on ACE-inhibitory rate

2.3 正交優化試驗

以單因素試驗為基礎，對葛根添加量、基質含水量和孢子懸浮液接種量進行正交優化設計以確定制備葛根降壓茶的最優發酵條件。正交試驗因素水平見表2，試驗設計及結果見表3。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Orthogonal test design

由表3可知，各因素對ACE酶活性抑制率影響大小依次為A>C>B，即葛根添加量對抑制ACE酶活性影響最大，孢子懸浮液接種量次之，基質含水量對發酵茶的ACE抑制率影響最小。發酵茶的最優條件為A2B1C3，即葛根添加量2 g、基質含水量20%、孢子懸浮液接種量5%，此條件下測得ACE酶活性抑制率平均值為76.13%(n=3)，且得到的葛根降壓茶氣味醇香、滋味回甘。發酵結束后高效液相色譜定量分析結果表明，茶多酚、生物堿等活性物質含量發生了不同程度的變化，同時ACE酶活性抑制率也顯著提高。

表3 正交試驗設計及結果Table 3 Orthogonal test design and results

2.4 給藥對自發性高血壓大鼠尾動脈收縮壓的影響

由表4可知，給藥4 h后，SHR-卡托普利組相較SHR-NaCl組最高降低了(2.81±0.57) kPa；與給藥前相比，灌胃卡托普利后SHR收縮壓降低了(2.48±0.44) kPa。SHR-H組在灌胃6 h后達到收縮壓的最低值，與SHR-NaCl組相比降低了(2.42±0.22) kPa，與給藥前相比降低了(2.14±0.56) kPa。與SHR-H組不同的是，SHR-M組在灌胃2 h后出現血壓升高的現象，隨后與SHR-H組相似，在灌胃6 h后達到最低收縮壓，比對照組降低了(1.20±0.27) kPa，且在6 h時相較SHR-M的給藥前降低了(1.28±0.27) kPa。SHR-M組整體降壓效果較SHR-H組弱，灌胃24 h后收縮壓也回升至給藥前的初始血壓。SHR-L組大鼠狀態較其他灌胃組躁動，表現為好斗。SHR-L組的收縮壓在灌胃4 h后開始降低明顯，并在12 h達到最大降壓效果，較SHR-NaCl組降低了(1.17±0.62) kPa，與給藥前相比在灌胃6 h時降低了(1.24±0.14) kPa，降壓效果與SHR-M組相似。說明灌胃卡托普利后降壓作用可維持18～20 h，SHR-H組可維持6～12 h，SHR-M組可維持6 h，而SHR-L組可維持約8 h。隨著葛根降血壓茶灌胃濃度的增加，SHR大鼠的收縮壓降低幅度也隨之變大，說明降壓效果與葛根降血壓茶的濃度有一定相關性，與鄔秀宏等[18]的研究結果相似。綜上，灌胃葛根降血壓茶對SHR大鼠具有顯著的降壓作用，且發酵茶的濃度越高，降壓作用越明顯。

發酵茶之所以可以對SHR起到急性降壓作用，是因其活性物質經微生物酶分解后生成的代謝產物作用于自發性高血壓大鼠體內的高血壓發病機制。ECG、大豆苷、染料木素、EC和大豆苷元是葛根降血壓茶中抑制ACE酶活性最相關的物質，且添加葛根有利于增加發酵茶對ACE酶活性的體外抑制率[14]，這有利于發酵茶改善腎素—血管緊張素—醛固酮系統(RAAS)調節。此外，羅顯揚等[19]發現“高原明殊”綠茶顯著降低了SHR大鼠的血漿Ang Ⅱ含量而發揮降壓功效。李汝月等[20]發現霉茶蛋白有一定降壓作用，可改善SHR腎臟組織炎性病灶，并可不同程度地降低TNF-α和TLR4等炎性因子的表達水平，從而對SHR不僅起到降壓作用，還對腎臟有保護作用。蔣榮華等[21]也發現廣西甜茶多酚能夠提高SHR血清中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和一氧化氮(NO)活性，改善左心室肥厚，最終明顯降低SHR的SBP和舒張壓(DBP)。另外，周堯等[22]檢測超微綠茶粉在體外消化的活性物質釋放量后發現，減少的黃酮類釋放量和增加的兒茶素類物質釋放有利于促進茶在體內的生物利用率。值得注意的是，葛根降血壓茶對SHR 在24 h后的急性降壓作用不再顯著，說明需長期服用。

2.5 給藥對自發性高血壓大鼠尾動脈收縮壓的影響

由表5可知，與SHR-NaCl組收縮壓相比，SHR-卡托普利組在灌胃12 h時降低了(1.94±0.15) kPa，SHR-H組在灌胃6 h時降低了(0.88±0.40) kPa，SHR-M組在灌胃6 h時降低了(0.66±0.40) kPa，并保持到12 h，SHR-L組的降舒張壓作用較弱，但在灌胃6 h也降低了(0.49±0.63) kPa。與陽性對照組相比，SHR-H組和SHR-L組在灌胃12 h的舒張壓顯著高于SHR-卡托普利組。與給藥前相比，SHR-卡托普利組顯著降低了SHR舒張壓，效果為4組給藥組中最顯著的，SHR-H組在灌胃4 h時下降顯著，SHR-M組在灌胃6 h時有明顯降壓作用，而SHR-L組在灌胃24 h時對SHR的舒張壓降壓效果不明顯。說明葛根降血壓茶對自發性高血壓大鼠的舒張壓作用也依賴于灌胃濃度，濃度越高，舒張壓的下降效果越明顯，而卡托普利對SHR舒張壓的改善作用優于葛根降血壓茶。

由表4、表5可知，與給藥前相比，t檢驗分析表明WKY-H在灌胃24 h內舒張壓和收縮壓均無顯著變化，即使是高劑量的灌胃，雖然有波動趨勢但最終基本維持在正常的舒張壓和收縮壓水平，說明葛根降血壓茶對正常大鼠的血壓影響不大。

表4 各試驗組對自發性高血壓大鼠尾動脈收縮壓的影響?Table 4 Effects on systolic blood pressure of spontaneously hypertensive rats (n=6)

表5 各試驗組對自發性高血壓大鼠尾動脈舒張壓的影響?Table 5 Effects on diastolic blood pressure of spontaneously hypertensive rats (n=6)

3 結論

試驗表明，在20 g綠茶基質的基礎上，添加2 g葛根、控制20%基質含水量、接種5%冠突散囊菌，發酵7 d后得到的最優發酵茶的血管緊張素轉換酶抑制率為76.13%。不同劑量的葛根降血壓茶對自發性高血壓大鼠在灌胃24 h內均有降低收縮壓和舒張壓作用，其中300～600 mg/kg的大鼠日用劑量的急性降壓效果最顯著，且發酵茶對正常血壓大鼠無明顯降壓作用，故初步推測不會影響正常人群的血壓。為了達到長期降壓功效，需長期飲用發酵茶。然而，食物來源的血管緊張素轉換酶抑制性生物活性成分在消化和吸收過程中可能會發生結構轉化，進一步降低其生物利用率和生物活性。所以以提高血管緊張素轉換酶生物利用率為目的或許可以開發出新型降壓產品。