自噬和衰老在放射誘導的多倍體宮頸癌細胞中的作用*

孟繁杰，閻英，熊嬋，王麗麗，趙松，邢思寧，于卉影

110016 沈陽， 北部戰區總醫院 基礎醫學實驗室(孟繁杰、王麗麗、趙松、邢思寧、于卉影)，放療科(閻英)；110016 沈陽，中國醫科大學 北部戰區總醫院研究生培養基地(熊嬋)

宮頸癌是目前全球女性常見的惡性腫瘤，也是女性癌癥高死亡率的原因之一[1-2]。近年來,隨著宮頸癌發病率不斷上升，放射治療已經成為中晚期宮頸癌的主要治療手段。但是患者個體對放射治療敏感性的差異，導致其預后差別明顯。即使分期相同、腫瘤體積類似的宮頸癌患者，在接受同等劑量的放射治療后仍有部分患者復發。因此，如何提高宮頸癌放射治療的療效成為臨床亟待解決的問題[3]。在一些放射處理的腫瘤細胞中常見到多倍體巨細胞[4]，Zhang等[5]研究發現，前列腺癌細胞中多倍體巨細胞侵襲和遷移能力更強，并且對常見的化療藥物(包括順鉑、多柔比星和5-氟尿嘧啶)高度耐藥。此外，有報道稱這些多倍體細胞可能經歷不對稱分裂(產生二倍體細胞)在體內進行自我更新，提示細胞的自噬與更新現象可能在腫瘤的放射抵抗中發揮著作用，然而其作用機制尚不明確[6-7]。本研究旨在分析放射誘發多倍體宮頸癌細胞的衰老與自噬現象，以探討多倍體宮頸癌細胞在放射誘導復發和抵抗中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 宮頸癌Hela細胞株為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清購自天津康源生物技術有限公司；RPMI1640培養基購自上海源培生物科技股份有限公司；兔抗人E2F-1、E2F-2抗體購自美國Santa cruz公司，兔抗人PLK1抗體、兔抗人PARP抗體、兔抗人LC3A/B抗體、鼠抗人SQSTM1/P62抗體、抗兔IgG(H+L)、F(ab′)2片段(Alexa Fluor 488 Conjugate)抗體、β-半乳糖苷酶檢測試劑盒均購自美國Cell Signaling Technology公司，Calcein/PI細胞活性與細胞毒性檢測試劑盒(Calcein/PI Cell Viability/Cytotoxicity Assay Kit)購自碧云天生物技術有限公司。兔抗人GAPDH抗體購自美國Sigma公司，Super Signal West Pico化學發光底物購自美國Pierce Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 Hela細胞在含10%的胎牛血清的RPMI1640完全培養基中培養，常規培養在37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 放射處理Hela細胞 將Hela細胞以2×104個/cm2的密度接種于T75培養瓶中培養24 h，使用Elekta Infinity直線加速器在6MV-X射線模式下給予7 Gy的劑量，照射完畢孵育24 h后更換新鮮的完全培養液繼續培養細胞至第3天、5天、7天、11天和19天，分別記為Control、Day 3組、Day 5組、Day 7組、Day 11組和Day 19組。光學顯微鏡下觀察細胞形態，并用ImageJ測量細胞的長直徑。

1.2.3 Live/Dead細胞檢測試驗 將各組細胞接種于24孔板中，每孔加入250 μL Calcein AM/PI檢測工作液，37℃避光孵育30 min。在熒光顯微鏡下觀察染色效果(Calcein AM為綠色熒光，PI為紅色熒光)并拍照。

1.2.4 細胞倍性檢測 使用80%冰甲醇于-20℃固定24 h，PBS溶液洗滌，PI室溫避光染色30 min，使用FACS Canto?Ⅱ流式細胞儀(美國BD公司)進行檢測。

1.2.5 Western blot檢測 使用超聲波破碎儀裂解各組細胞，經過離心提取細胞蛋白，應用BCA法測定各組蛋白的濃度，應用SDS-PAGE凝膠電泳，轉印，使用脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4 ℃搖床過夜，二抗室溫孵育2 h，ECL試劑發光，X線片夾中顯影。

1.2.6 β-半乳糖苷酶檢測 收集各組細胞用固定液室溫固定10 min，加入10 μL β-半乳糖苷酶染色液A、10 μL β-半乳糖苷酶染色液B、930 μL β-半乳糖苷酶染色液C和50 μL X-gal，37℃孵育4 h，普通光學顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.7 生物信息學分析 PLK1是一種蛋白激酶，與DNA損傷應答相關，常提示細胞進入衰老狀態，在一些癌組織中過度表達[8]，本研究利用 GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)對PLK1在正常宮頸組織和宮頸癌組織的表達差異進行分析。

1.2.8 統計學方法 所有實驗均重復3次，所有數據采用SPSS 22.0軟件處理數據，計量資料數據采用均數±標準差表示，兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗的方法進行分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 放射誘導的多倍體宮頸癌細胞的形態和DNA含量的變化

Hela細胞經7 Gy放射處理，Day 3組和Day 5組細胞體積明顯增大，Day 5組的大細胞周圍有小細胞的存在(圖1A)，Day 3組、Day 5組、Day 7組和Day 11組細胞平均直徑高于對照組，差異均具有統計學意義(P<0.05;圖1B)，且Day 3組和Day 5組大細胞均為活細胞(圖1C)。與對照組相比，Day 3組、Day 5組、Day 7組和Day 11組多倍體細胞亞群(DNA含量>4N)比例均明顯高于對照組，差異均具有統計學意義(P<0.05)；在Day 5組中多倍體細胞亞群比例達到高峰，隨后多倍體細胞亞群比例下降(圖2)。Day 19組中多倍體細胞減少至正常水平，與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 經7 Gy照射后Hela細胞形態學變化及活性(×200)

圖2 經7 Gy照射后Hela細胞倍性變化

2.2 放射誘導的多倍體宮頸癌細胞發生衰老現象

β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測衰老標志物β-半乳糖苷酶的表達。經7 Gy處理后，Day 3組、Day 5組和Day 7組中多數細胞的β-半乳糖苷酶表達呈陽性，并與對照組相比差異有統計學意義，表明放射誘導Hela細胞發生衰老現象(圖3A、B)。Western blot檢測衰老相關蛋白的表達，結果顯示，與對照組相比,Day 3組和Day 5組細胞DNA損傷修復蛋白PARP表達下調，DNA合成相關蛋白E2F-1、E2F-2表達下調，DNA損傷應答相關蛋白PLK1表達上調。然而，Day 19組這些蛋白都恢復到正常水平，與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05;圖3C、D)。

圖3 經7 Gy照射后Hela細胞衰老變化

2.3 放射誘導的多倍體宮頸癌細胞發生自噬現象

Western blot檢測自噬相關蛋白的表達，結果顯示與對照組相比,Day 3組、Day 5組和Day 7組自噬相關蛋白 LC3-II/LC3-I 比值表達上調，自噬特異性底物P62蛋白表達下調，Day 19組P62表達下調(圖4)。

圖4 經7 Gy照射后Hela細胞自噬相關蛋白的表達

2.4 PLK1在宮頸癌組織中的表達水平

利用GEPIA網站進行生物信息學分析發現，與正常組織(n=13)相比，PLK1在宮頸癌組織(n=306)中高表達(P<0.05;圖5)。

圖5 GEPIA網站驗證PLK1在宮頸癌組織中的表達(*P<0.05)

3 討 論

近年來，放射治療已經成為局部中晚期宮頸癌的主要治療手段[9]。然而，經放射治療后仍有約30%～40%的宮頸癌患者出現局部復發、轉移、惡性加重等情況，這可能與腫瘤在放射治療期間產生的放射抵抗性有關[10]。放射抵抗性的產生成為臨床腫瘤放射治療的主要障礙。有研究發現癌細胞的衰老是可逆的，并且其可逆性可能與治療誘導的細胞多倍體化有關[11]。因此，多倍體化可能代表一種逃避化療和放射治療毒性的機制，從而促進癌癥的復發。自噬在癌細胞的進展和生存中起著非常復雜的作用，正如Erenpreisa等[12]所預測的那樣，自噬可能參與衰老/多倍體癌細胞發生去倍增殖。這些研究結果提示，自噬和衰老現象可能是促進多倍體腫瘤細胞在體內的自我更新，進而導致腫瘤放射抵抗和復發的關鍵。

在本研究中，我們觀察發現經放射誘導的Hela細胞在Day 3組、Day 5組中體積增大且呈多倍體狀態，并且Day 5組的大細胞周圍開始出現體積正常的小細胞。隨著時間延長，多倍體細胞比例下降，取而代之的是大量體積正常的細胞。流式細胞術檢測結果也證實了Hela細胞經7 Gy劑量放射誘導出現DNA含量大于四倍體的多倍體細胞，并且隨著時間延長多倍體細胞比例逐漸下降。上述結果表明，放射誘導Hela細胞過渡性地產生大量多倍體細胞，隨后逐漸恢復到二倍體狀態。本研究還發現，多倍體細胞的形成伴隨著衰老現象，在Day 3組、Day 5組多倍體細胞中衰老特征性檢測指標β-半乳糖苷酶呈陽性。同時，伴隨著DNA損傷修復蛋白PARP、參與DNA合成的E2F-1、E2F-2蛋白表達下調，DNA損傷應答相關蛋白PLK1表達上調，表明細胞進入衰老狀態。在Day 11組和Day 19組多倍體細胞逐漸恢復到二倍體狀態之時，DNA損傷修復蛋白PARP逐漸升高，同時細胞衰老特征性檢測指標β-半乳糖苷酶和衰老相關蛋白恢復到正常水平，提示多倍體細胞雖然發生衰老現象，但并沒有使宮頸癌細胞趨向死亡，而是對損傷DNA進行修復，并且幫助多倍體宮頸癌細胞擺脫細胞分裂阻滯，進入增殖狀態[12]。衰老對于癌細胞可能不是障礙，而是癌癥發展的驅動力，并且多倍體的形成以及不對稱分裂可能在這個過程中起著至關重要的作用[13]。

通過GEPIA網站分析發現，PLK1在宮頸癌中呈高表達狀態。有研究表明PLK1高表達可以降低乳腺癌細胞對體外和體內的放射敏感性導致放射治療后腫瘤的復發[14]。我們的結果顯示，經放射誘導Hela細胞Day 3組、Day 5組PLK1表達水平和自噬相關蛋白 LC3-II/LC3-I比值上調，自噬特異性底物P62蛋白表達下調，提示細胞可能通過發生自噬，并與PLK1協同作用降低宮頸癌細胞對放射治療敏感性，導致放射治療后腫瘤復發。自噬在癌癥中起著重要的作用，有研究表明自噬可能通過誘發細胞衰老來維持細胞周期阻滯狀態，保護細胞[15-18]。然而，自噬和細胞衰老之間的作用機制尚不明確[19-20]。

綜上所述，放射誘導的宮頸癌細胞出現衰老和自噬現象可能有助于維持細胞周期阻滯狀態并產生多倍體細胞，來幫助宮頸癌細胞從放射誘導的細胞損傷中進行自我修復。然而，目前放射誘導宮頸癌細胞衰老、自噬和多倍體化的機制尚不明確，我們后續會進一步研究自噬和衰老之間的關系及其產生多倍體細胞的作用機制。我們推測,Hela細胞經過放射處理后發生DNA損傷并形成多倍體細胞，為了避免DNA損傷導致的宮頸癌細胞死亡，細胞啟動衰老并對受損的多倍體細胞DNA進行修復。伴隨著多倍體細胞的去倍化，宮頸癌細胞擺脫衰老進入增殖狀態。多倍體細胞是巨大的、多核的、同時包含受損的DNA碎片和一些受損的細胞廢物，所以需要功能性自噬來維持其活性。我們推測多倍體細胞的去倍增殖需要激活自噬，自噬調節可能是癌細胞抵抗化療/放射治療的重要機制。在后續研究中，我們將進一步觀察調控自噬水平是否能影響Hela細胞的放射敏感性，可能為提高宮頸癌對放射治療的敏感性并改善放射治療效果提供新的潛在靶點。

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