銅誘導調節性細胞死亡的作用機制與抗腫瘤治療的研究進展

朱潔潔，王華，2

(1. 安徽醫科大學第一附屬醫院腫瘤科，安徽 合肥 230031； 2. 安徽醫科大學炎癥免疫性疾病安徽省實驗室，安徽 合肥 230032)

銅是一種生物必需的過渡金屬元素，可作為多種酶的輔因子參與各種酶促反應和重要的生物學過程，維持機體正常的生長發育和細胞代謝等。銅含量過載或缺乏可導致細胞功能受損，最終導致細胞死亡[1]。一般來說，細胞可能死于意外細胞死亡(accidental cell death, ACD)或調節性細胞死亡(regulated cell death, RCD)。 ACD是生物學上不可控的過程，而RCD涉及復雜的級聯信號通路和分子效應機制。生理情況下發生的RCD通常稱為程序性細胞死亡(programmed cell death， PCD)，而細胞凋亡是PCD中研究最廣泛的一種形式，是可調控的、由基因控制的細胞自主和有序的死亡，其形態特征包括細胞皺縮、染色質凝集、核碎裂和DNA片段化等[2]。 目前發現的RCD類型已經超過10種，除了常見的細胞凋亡，還包括多種非凋亡型RCD，如自噬、鐵死亡、焦亡和內源性細胞死亡等[3-4]。Tsvetkov等[5]于2022年3月份在頂級學術期刊Science上提出一種新的不同于已知的RCD方式，并命名為“銅死亡(cuprotosis)”，是一種依賴于銅的、可受調控的新型死亡方式，并且與線粒體呼吸緊密相關。

近來研究發現，銅離子含量超載或缺乏可導致各種疾病，如與年齡相關的神經退行性疾病如阿爾茨海默病[6]、銅代謝障礙的遺傳性疾病如肝豆狀核變性[7]和慢性肝腎疾病如腎纖維化等[8]。研究表明，腫瘤患者血清和實體腫瘤組織中的銅離子含量顯著高于健康者[9-10]，其含量增加可促進腫瘤細胞的增殖與轉移、促進血管生成等[11]。銅配合物是由銅離子與某些配體以配位鍵結合形成的配位化合物，其可與DNA和蛋白質作用，誘導氧自由基產生，并破壞磷酸二酯鍵，進而促進DNA水解[12]。因此，本文針對銅誘導調節性細胞死亡的作用機制及銅配合物在腫瘤治療中的研究進展作一簡要綜述。

1 銅的吸收和分布

銅主要通過食物獲取，經腸道細胞吸收，成年人每日膳食中銅攝入量為0.9 mg[13]。銅在機體內以亞銅離子(Cu+)和銅離子(Cu2+)兩種形式存在。目前認為，細胞外銅離子以Cu2+的形式存在，與二價金屬轉運體1(divalent metal transporter 1，DMT1)結合后經還原酶還原為Cu+，進而與跨膜銅轉運體1(copper transporter 1, CTR1)結合后進入細胞[14]。然后，Cu+通過胞質、線粒體和高爾基體3種途徑靶向至不同的銅蛋白[15]。最后，這些與銅離子組裝的銅蛋白經分類至特定的細胞器或依賴于銅伴侶蛋白抗氧化物1(Atox1)/ATP酶途徑分泌至循環血液中[16-17]。

2 銅誘導調節性細胞死亡的作用機制

體內銅離子含量維持動態平衡，當平衡失調時，可產生細胞毒性，并通過多種途徑誘導細胞死亡。另外，若機體暴露于大量的銅外源物，吸收過量的Cu2+，則使體內羥基自由基產生增加，細胞內活性氧水平升高，致脂質過氧化增強，進而導致氧化應激和細胞凋亡[18-19]。此外，CTR1過表達和細胞內谷胱甘肽(glutathione, GSH)的耗竭均可增強銅離子誘導的細胞死亡，突觸核蛋白過表達也可通過調節蛋白質降解途徑加劇多巴胺能細胞中的銅離子毒性[20]。

2.1 氧化應激誘導細胞凋亡

體內細胞維持氧化和抗氧化動態平衡，當平衡紊亂時即可產生氧化應激，導致相關細胞損傷從而誘發腫瘤形成[21]。芬頓(Fenton)反應是最重要的金屬介導型反應之一，如反應a與b所示，銅離子在氧化和還原狀態之間循環，并形成羥基自由基[22]。羥基自由基可與DNA和脂質反應，分別引起DNA損傷和脂質過氧化[23]。

由于腫瘤細胞的高增殖率和高能量需求，其處于比正常生理細胞更高的活性氧應激狀態，更易介導細胞凋亡[24-25]。銅離子載體與銅結合時產生活性氧，可誘導氧化應激，損傷DNA，導致細胞周期阻滯[26]。Shimada等[27]研究表明，NSC319726除可作為Zn2+載體，還可作為Cu2+載體在多種癌細胞模型中起作用，其結合并激活Cu2+，促進Cu2+與Cu+之間的氧化還原反應，致脫氧核糖核苷酸耗竭，無法合成DNA，使細胞周期停滯于G1期，進而觸發細胞凋亡。Yip等[28]研究發現，雙硫侖對體外培養的乳腺癌細胞有較強的銅依賴性毒性，雙硫侖和Cu2+結合應用可抑制乳腺癌細胞集落形成，并顯著增強紫杉醇的細胞毒性；其具體機制為雙硫侖-Cu2+復合物誘導產生活性氧，進而激活其下游與細胞凋亡相關的JNK和p38 MAPK通路，同時抑制NF-κB信號途徑，從而誘導乳腺癌細胞凋亡。由此說明，銅離子與抗癌藥物結合產生活性氧，形成氧化應激，抑制抗凋亡因子，激活凋亡相關通路，從而誘導癌細胞凋亡。另外，銅衍生的銅配合物也可促進癌細胞凋亡。Cen等[29]研究發現，Cu2+與雙硫侖通過復雜的胞外氧化還原反應形成配合物二乙基二硫代氨基甲酸銅[Cu(deDTC)2]，該銅配合物抗黑色素瘤活性較高，導致黑色素瘤細胞株凋亡率明顯增加。這種氧化還原反應為Cu2+所特有，其他金屬如鐵、錳等離子則無。

2.2 抑制泛素—蛋白酶體系統

泛素—蛋白酶體介導的蛋白酶解系統調節多種蛋白的表達水平和活性，參與調節細胞周期、增殖和凋亡等細胞過程[30]。該蛋白酶解系統中蛋白降解包括泛素化和降解兩條不同途徑。泛素化是指通過泛素標記靶蛋白，使蛋白酶體復合體選擇性地識別靶蛋白進而將其降解。目前，蛋白酶抑制劑如硼替佐米已廣泛應用于多發性骨髓瘤等疾病的治療，表現出強抗腫瘤活性[31]。Chen等[32]研究發現，雙硫侖-Cu2+配合物在誘導乳腺癌細胞凋亡開始之前，乳腺癌細胞內蛋白酶體活性持續受到抑制，致使泛素化蛋白增加，而且該過程在正常的乳腺細胞中尚未發現；除此之外，雙硫侖和Cu2+分別單獨作用時對乳腺癌細胞的蛋白酶體活性抑制作用很小，說明抑制蛋白酶體系統的是Cu2+，雙硫侖將Cu2+攜帶至乳腺癌細胞中并阻止其與其他非特異性蛋白質相互作用。Skrott等[33]研究發現，雙硫侖-Cu2+配合物可阻斷蛋白酶解系統上游的信號傳導，損害泛素化依賴性的ATP合酶，即含纈酪肽蛋白的功能，進而抑制泛素化蛋白的降解。由此表明，Cu2+配合物可成為有效的蛋白酶體抑制劑，抑制某些腫瘤細胞的蛋白酶體活性，進而抑制細胞增殖。

2.3 誘導銅依賴性細胞死亡

Tsvetkov等[34]在2019年研究發現，線粒體能量代謝改變時，氧化磷酸化過程致腫瘤細胞對蛋白酶體抑制劑耐藥性增強，但對新型小分子藥物伊利司莫(elesclomol)的敏感性也增強。伊利司莫是一種銅離子載體，目前為抗癌藥物，其可與Cu2+絡合形成配合物。伊利司莫-Cu2+配合物進入細胞內，Cu2+經鐵氧化還原蛋白1(ferredoxin 1, FDX1)還原成Cu+，進一步導致細胞死亡，其具體作用機制尚不明確。Caspase-3和Caspase-7是細胞凋亡通路的下游效應因子，但抑制二者活性后，伊利司莫介導的細胞死亡不受影響。鐵死亡是一種鐵依賴性的非凋亡形式調節細胞死亡的過程[35]，但鐵死亡抑制劑不能挽救伊利司莫誘導的細胞死亡。由此說明，伊利司莫參與促進一種獨特的銅依賴性細胞死亡，且不能被細胞凋亡抑制劑或鐵死亡拮抗劑所阻斷。

2022年3月，Tsvetkov等[5]研究首次指出，銅誘導的細胞死亡由蛋白質脂?；閷?，且與線粒體活性相關，并首次將這種銅依賴的新型死亡方式命名為“銅死亡(cuprotosis)”。銅死亡所涉及的蛋白質脂酰化過程是一種罕見且高度保守的賴氨酸翻譯后修飾，目前哺乳動物中只發現4種脂酰化蛋白質組成的酶復合體，包括丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase, PDH)、α-酮戊二酸脫氫酶(alpha-ketoglutarate dehydrogenase, KDH)、支鏈α-酮酸脫氫酶(branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase, BCKDH)和甘氨酸裂解體系(glycine cleavage system, GCV)[36]。PDH和KDH直接參與三羧酸循環，BCKDH則負責支鏈氨基酸分解代謝中的脫羧基過程，而GCV在甘氨酸的分解代謝中發揮重要作用[36-37]。這些酶對維持線粒體正常代謝至關重要，其直接或間接參與線粒體三羧酸循環，與銅離子結合后導致脂?；牡鞍踪|聚集，致線粒體代謝功能紊亂，進而誘導細胞死亡。敲除脂?；鞍椎年P鍵上游調節因子FDX1或脂酰化相關酶則可以阻斷銅死亡。Tsvetkov等[5]研究同時發現，銅毒性與線粒體活性之間關系密切，這可能與線粒體代謝旺盛、三羧酸周期活躍的細胞的脂?；鞍姿捷^高有關。該機制解釋了與遺傳性銅超載障礙相關的發病原因，也提供了腫瘤治療的新視角。

3 銅配合物在腫瘤治療中的應用

研究表明，銅離子參與上皮—間充質轉化、絲裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)等信號通路激活，還可調節自噬過程、促進腫瘤周圍的血管生成等，進而影響腫瘤細胞的增殖和轉移[38-40]。目前認為銅是抗腫瘤藥物的候選金屬材料。由于銅的生理特性及其活躍的氧化還原反應能力，Cu+和Cu2+可與多種配體結合，其中，Cu+可與雙膦配體、氮配體、多吡啶等結合，Cu2+可與席夫堿、雙硫侖、對氯苯甲酸等配體結合，從而產生多種不同的銅配合物。隨著納米技術的發展，尺寸較小、生物相容性好、可以靶向至腫瘤中的銅納米材料也開始應用于腫瘤治療中。

3.1 化學動力學療法

近來，化學動力學療法(chemodynamic therapy，CDT)作為一種新興的治療方式受到了廣泛關注。CDT指腫瘤組織中產生的H2O2通過金屬離子介導的芬頓或芬頓類反應轉化為具有強氧化性的羥基自由基，進而殺死腫瘤細胞[41]。與化療不同，CDT無須引入抗癌藥物和外界刺激，不良反應小、操作簡單，是腫瘤治療的一個新興方向。研究報道，幾種含銅配合物在腫瘤治療中具有潛在的應用價值。Kordestani等[42]研究指出，采用硝酸銅、乙二胺、3，5-二溴水楊醛和三乙胺等原料合成的Cu2+配合物——3，5-二溴水楊醛亞胺合硝酸銅，可抑制人A2780卵巢癌細胞增殖；與卵巢癌化療敏感藥物順鉑相比，其半數抑制濃度較低。為更好地提高藥物對腫瘤細胞的特異性，Luo等[43]制備了一種簡單可行的生物素化的含Cu+配合物——生物素氯化亞銅復合物(Bio-CuCl)，其中的生物素部分可以靶向生物素受體陽性的腫瘤細胞，特異性地殺傷腫瘤細胞。但是，納米顆粒的穿透能力差和腫瘤細胞具有的抗氧化活性降低了CDT的療效。基于此，Zheng等[44]將銅納米顆粒用鋅原卟啉IX負載，用聚乙二醇化的氧化鉬銅(CuMoOx)包裹，通過抑制血紅素氧合酶-1的活性，結合GSH并阻斷其抗氧化作用，為CDT提供了良好的易氧化的微環境，增強了殺傷腫瘤細胞的效果。

單一的治療方式往往導致腫瘤細胞耐藥的發生，協同治療可提高療效。Chen等[45]研究發現，協同饑餓—CDT治療可有效地抑制腫瘤生長；其通過層層組裝，將CuS納米顆粒包裹在多聚賴氨酸—葡萄糖氧化酶—透明質酸殼中，構建出一種花生狀納米藥物，其中，透明質酸殼層對CD44的電荷轉化和特異性識別不僅為銅納米藥物提供了較長的循環時間和特異性的腫瘤靶向能力，而且使其在腫瘤部位有較長的作用停留時間；葡萄糖氧化酶暴露后，消耗內源性葡萄糖進行饑餓治療，然后通過Cu2+介導的芬頓類反應轉化為劇毒的羥基自由基進行CDT。此外，該納米顆粒還可招募不同的免疫細胞進行抗腫瘤免疫治療。Cu2+和DNA酶二者組合成混合納米材料，通過協調相互作用共同轉運至腫瘤細胞中，釋放的Cu2+經GSH還原為Cu+，用于CDT；DNA酶可用來切割RNA，它可高效切割血管內皮生長因子-2(VEGF2)mRNA，致VEGF2基因表達下調從而實現基因治療。由Cu2+和DNA酶配位組合形成的配合物誘導聯合抗腫瘤效應，有效抑制體內腫瘤的生長[46]。

3.2 光療

腫瘤局部光療法是一種新興的可有效抑制腫瘤生長的方式，主要包括光動力療法和光熱療法，依靠光療劑(包括光敏劑和光熱試劑)將光能轉化為化學能或熱能，從而殺死腫瘤細胞[47]。光療中的光照度可從空間控制，只照射目標部位，選擇性地作用于腫瘤細胞。光熱動力療法采用的是可穿透組織的光敏劑，將其注射至人體，由于腫瘤組織的高吸收、低代謝的特點，光敏劑可以特異性地滯留在腫瘤組織內，然后經特定波長的激光激活，催化一系列化學反應產生活性氧，從而誘導腫瘤細胞死亡[48]。該療法對光敏劑性能要求較高，需組織滲透性高、光毒性強。Wang等[49]研究發現，羧基與銅離子配合形成的新型銅配合物碳點銅(copper-doped carbon dots, Cu-CDs)，可產生良好的光誘導細胞毒性，有效地抑制人宮頸癌細胞和神經母細胞瘤細胞生長。由此表明，碳點銅可能是一種有前景的光敏試劑。Shrestha等[50]研究發現，銅半胱胺納米粒子作為新型的光敏劑，經X射線輻射激活后可使小鼠皮下種植的右側乳腺癌腫瘤組織體積顯著減小，其可能是進行深部腫瘤光熱動力療法的良好候選者。

除了光熱動力療法，光熱療法也很常見，其通過利用具有近紅外吸收的光熱材料在激光照射下實現局部高溫，從而有效地殺滅腫瘤細胞。Weng等[51]通過在氬氣下經不同的溫度制備出一種新型的光熱劑——負載在碳多面體中的銅納米顆粒；靜脈注射該納米顆粒后行808 nm波長光照，3 min內小鼠皮下種植宮頸癌腫瘤部位溫度急劇上升，10 min后腫瘤部位最終溫度為64.6 ℃，從而達到有效的熱療效果，并且20 d后小鼠腫瘤組織完全消退；與之相反，靜脈注射PBS的小鼠腫瘤組織在連續光照下沒有明顯的溫度變化，20 d后腫瘤體積明顯增大。由此說明，該納米材料具有較好的近紅外光吸收特性，光熱轉換效率高，其制成的光熱劑有潛在的應用前景，可用于抗腫瘤治療。Hou等[52]研究發現，轉鐵蛋白修飾的介孔空心硫化銅納米顆粒材料在荷瘤小鼠的乳腺癌腫瘤部位處的局部蓄積和滯留時間長，具有較強的近紅外吸收和光熱轉換效率，可有效地將近紅外光轉化為熱能用于光熱治療，同時還可以產生高水平的活性氧用于光動力治療。

3.3 化療

研究表明，銅配合物與化療藥物聯合使用可增強化療藥物的敏感性，具有良好的協同作用。Bortolozzi等[53]研究發現，在兩種急性淋巴細胞白血病的細胞系(RS4;11和SEM細胞系)中，由Cu2+配位而成的配合物——六氟磷酸三羥甲基膦銅，與常見化療藥物地塞米松、柔紅霉素、阿糖胞苷和長春新堿分別聯合治療，以協同方式增強了藥物單獨作用時的抗急性淋巴白血病細胞增殖作用，尤其是與阿糖胞苷協同作用較強。銅配合物可通過影響銅穩態調節過程在鉑類藥物的治療中發揮重要作用[54]。D-青霉胺可與Cu2+形成配合物，致體內Cu2+含量降低，CTR1蛋白表達上調，從而增強奧沙利鉑對人結腸癌細胞株的細胞毒作用[55]。同樣，研究發現，在宮頸癌模型小鼠(HPV16/E2)中，銅螯合物四硫代鉬酸鹽聯合順鉑治療的小鼠體內CTR1 mRNA表達水平增高，順鉑對小鼠宮頸癌細胞的攝取和殺傷力增強，抗腫瘤效果增強[56]。銅轉運ATP酶α(ATP7A)和銅轉運ATP酶β(ATP7B)為銅轉運體，介導銅離子的轉運和排泄，研究發現，二者高表達與卵巢癌、非小細胞肺癌、結直腸癌等腫瘤患者的預后差和對鉑類藥物的耐藥性有關[57]。由此推測，銅和鉑類藥物可能共享同一攝取、轉運系統，而銅配合物可通過降低銅離子含量，改變銅轉運體活性，增強鉑類攝取，進而增強鉑類的抗腫瘤效果。但是，具體何種類型腫瘤適合于以銅為靶點或利用銅的治療仍有待深入研究。

3.4 免疫治療

腫瘤免疫療法是一種刺激免疫系統重啟，使機體恢復并維持抗腫瘤免疫反應的方法。抗程序性死亡蛋白1(programmed death protein 1, PD-1)和程序性死亡受體—配體1(programmed death-ligand 1, PD-L1)是兩個重要的免疫檢查點蛋白。腫瘤細胞表達的PD-L1與T淋巴細胞表面的受體PD-1結合，可以抑制細胞毒性T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，從而引起免疫抑制[58]。近來研究發現，銅可以調節PD-L1表達。Voli等[59]研究發現，在神經母細胞瘤細胞中由于CTR1表達增加，導致Cu2+含量增加，并激活表皮生長因子受體信號通路，導致PD-L1 mRNA和蛋白表達水平增加；當給予神經母細胞移植瘤模型小鼠服用銅絡合劑四乙烯五胺五鹽酸鹽時，Cu2+含量降低，神經母細胞瘤細胞中PD-L1表達降低，導致腫瘤浸潤性T細胞數增加，腫瘤生長減緩，小鼠存活率提高。由此表明，通過藥物降低腫瘤內銅離子含量可增強抗腫瘤免疫治療。

4 結語

銅作為機體必需的一種微量金屬，在細胞代謝中起重要作用。體內銅離子含量保持動態平衡，過量或缺乏可導致多種疾病。銅可通過多種方式誘導調節性細胞死亡，如誘導氧化應激、抑制蛋白酶體等，以及最新發現并命名的“銅死亡”，促進以銅為靶點的抗腫瘤治療。目前針對銅穩態治療的抗腫瘤作用機制主要有兩種，一種是銅絡合劑，結合銅離子并降低其含量，抑制腫瘤細胞的增殖和轉移；另一種是銅離子載體，將銅離子輸送至細胞內，以增加細胞內Cu2+水平，產生活性氧等，誘導腫瘤細胞死亡[54，60]。銅配合物也可與傳統的化療、放療等協同作用，增強抗腫瘤療效。