鈦表面芬母多肽涂層的構建及其抗菌性能探究

吳奇蓉，雷 晨，吳 迪，周和陽，湯春波

鈦及其合金具有穩(wěn)定的化學性質和良好的生物相容性，是牙科植入物的主要材料。隨著臨床上的廣泛運用，也暴露出了一些不足。種植體周圍炎是影響種植體長期成功率的重要原因[1]。細菌定植在種植手術后幾分鐘內(nèi)發(fā)生，并貫穿種植體的整個生命周期[2]，理想的表面材料能夠在初次接觸時清除或殺滅病原體來防止生物膜的形成，這對種植體的存活至關重要[3]。

一些金屬離子、非金屬化合物和生物分子已被用作抗菌涂層的制備。含有Zn[4]、Ag[5]、Mg[6]、碘[7]、氯己定[8]等的涂層已被證實具有良好的抗菌效果，然而隨著時間的推移，抗菌物質釋放逐漸減少，其抗菌性能也會降低。抗菌肽(antimicrobial peptide，AMP)是天然免疫系統(tǒng)的一部分，具有廣譜的抗菌活性，近年來被廣泛研究，可以為改性材料提供長期的抗菌效果[9-10]。Wang等[11]通過多巴胺自聚合將陽離子抗菌肽DJK-5共價錨定到預活化的多孔鈦合金表面，制備了一種新型的多功能涂層，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抗菌效率均在90%以上。Boix-Lemonche等[12]將一種α-螺旋抗菌肽BMAP-27共價結合到鈦表面，能有效預防細菌定植。

芬母多肽(funme peptide，F(xiàn)P)是一種來源于BMAP-27的重組抗菌肽，分子質量為2 474.580 6 u，與親本AMP相比，F(xiàn)P具有分子質量小、抗菌活性高、溶血活性低等特點[13]。同時具有熱穩(wěn)定性和較好的水溶性；作用于細菌細胞膜，導致膜的通透性增大，對革蘭氏陽性菌、真菌、寄生蟲以及病毒等具有較強的殺菌和有效抑制作用，對高等動物正常細胞幾乎無毒害作用；且不易產(chǎn)生耐藥性[14-15]。硅烷化是一種通過材料表面的羥基將有機官能化的烷氧基硅烷分子固定，然后與多肽反應、結合的過程。形成的結合是共價結合，穩(wěn)定且處理簡便[16-17]。

為了探討將FP負載在鈦表面以減少感染的可能性，我們采用硅烷化處理將FP共價結合到大顆粒噴砂酸蝕(sandblast and acid-etching，SLA)鈦表面，通過檢測MC3T3-E1細胞的黏附和增殖、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)的活性對其生物相容性及抗菌性能進行了探究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醫(yī)用四級純鈦片(TA4，高潔麗康，中國)，濃硫酸、濃鹽酸、氫氧化鈉、無水戊烷、3(氯丙基)-三乙氧基硅烷(3-chloropropyltriethoxysilane，CPTES)、N,N-二異丙基乙胺(N,N-diisopropylethylamine，DIEA)(國藥，中國)，磷酸鹽緩沖液(PBS，Gibco，美國)，BCA蛋白試劑盒(碧云天，中國)，羅丹明-鬼筆環(huán)肽(翊圣生物科技，中國)，DAPI(碧云天生物科技，中國)，CCK-8 試劑盒(同仁，日本)，LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基(阿拉丁，中國)，芬母多肽(FP，吉銳生物，中國)，小鼠顱骨前成骨細胞系MC3T3-E1(中喬新舟，中國)，S.aureus(ATCC 25923，無錫賽維，中國)，Quantera Ⅱ X射線光電子能譜儀(PHI，美國)，SL200B靜態(tài)水接觸角檢測儀(梭倫，中國)，DMI3000B倒置熒光顯微鏡(Leica，德國)，SpectraMaxMe多功能酶標儀(Molecular Devices，德國)，SCAN 1200全自動菌落分析儀(Interscience，法國)。

1.2 樣品制備

1.2.1 SLA表面制備 用SiC砂紙(400、800、1 200、1 800目)將鈦片逐級打磨拋光直至表面光滑，超聲清洗后烘干。在30 kPa的壓強下用80目的氧化鋁顆粒對純鈦表面垂直噴砂處理，超聲清洗后烘干。經(jīng)濃硫酸/濃鹽酸混合溶液(36.0% H2SO4、5.8% HCl)在60 ℃水浴條件下酸蝕6 h，超聲清洗烘干，獲得SLA鈦表面作為對照。

1.2.2 FP涂層的構建 實驗組在SLA的基礎上用5 mol/L NaOH溶液60 ℃水浴處理30 min，超聲清洗烘干。然后順序加入無水戊烷、CPTES和DIEA(體積比11.7∶2∶1)使鈦片浸沒，室溫浸泡1 h，用異丙醇、無水乙醇、雙蒸水依次超聲清洗后烘干。最后將FP凍干粉末用PBS配制成0.2、1.0、5.0 mg/mL三個質量濃度，鈦片浸泡過夜，獲得SLA-0.2、SLA-1、SLA-5三個實驗組，紫外線消毒備用。

1.3 表面元素分析

用X射線光電子能譜儀分析樣品表面的化學成分。工作功率為150 W，在7.5×10-7Pa的壓強、0.1 eV階躍下，通過能量為25 eV的高分辨率光譜進行記錄。使用Casa XPS 2.3.16軟件分析數(shù)據(jù)。

1.4 水接觸角

將2 μL的超純水滴在樣品表面，用靜態(tài)水接觸角檢測儀在24 ℃下記錄10 s內(nèi)的接觸角。

1.5 蛋白吸附

消毒后的SLA、SLA-0.2、SLA-1和SLA-5樣品(n=3)分別放置于24孔板中，每孔加入1 mg/mL牛血清白蛋白(BSA)溶液1 mL，37 ℃孵育1 h。PBS輕洗3次后，加入10% SDS裂解液處理1 h，洗脫收集樣品表面吸附的蛋白，與BCA工作液混勻，37 ℃孵育30 min，在562 nm的波長下測得光密度D，根據(jù)標準蛋白曲線計算蛋白濃度。

1.6 生物相容性檢測

1.6.1 細胞黏附 消毒后的各組樣品(n=3)分別放置于24孔板中，將MC3T3-E1細胞以3×104個/孔的密度接種到材料表面。培養(yǎng)4 h后，用PBS輕洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，0.1% Triton X-100通透細胞5 min。避光條件下，先用羅丹明-鬼筆環(huán)肽對細胞骨架染色30 min，再用DAPI對細胞核染色1 min。用倒置熒光顯微鏡觀察并記錄材料表面細胞黏附與鋪展情況。

1.6.2 細胞增殖 消毒后的各組樣品(n=3)分別放置于24孔板中，將MC3T3-E1細胞以3×104個/孔的密度接種到材料表面。培養(yǎng)1、3、5 d后，分別加入含10% CCK-8的完全培養(yǎng)基避光孵育2 h，用多功能酶標儀測定450 nm處的光密度D。

1.7 抗菌性檢測

1.7.1 細菌培養(yǎng)S.aureus用LB固體培養(yǎng)基在37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d進行傳代。

1.7.2 菌落計數(shù)和抑菌率檢測 以LB液體培養(yǎng)基為溶劑，1×106CFU/mL為濃度，制備S.aureus懸濁液。消毒后的各組樣品(n=3)分別放置于24孔板中，每孔加入1 mL菌液，37 ℃培養(yǎng)24 h。棄菌液，PBS清洗2次洗去浮菌。每孔加入1 mL PBS，用超聲將樣品表面S.aureus洗脫，梯度稀釋菌液，各取100 μL接種于LB固體培養(yǎng)基上，用L形棒均勻涂抹。37 ℃培養(yǎng)24 h后，用全自動菌落分析儀計數(shù)細菌菌落(CFU)，按以下公式計算抑菌率：抑菌率=(對照組菌落-實驗組菌落)/對照組菌落×100%。

1.8 統(tǒng)計學方法

每項實驗重復3次，采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用GraphPad Prism 5軟件繪制圖表，采用單因素方差分析和t檢驗統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，當P<0.05時，認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 表面元素

材料表面的化學成分如圖1所示，相對于SLA組，實驗組樣品中有硅(Si 2p)存在，同時碳(C 1s)和氮(N 1s)的含量增加，氧(O 1s)和鈦(Ti 2p)的含量降低。

*：P<0.05

2.2 水接觸角

材料表面的水接觸角如圖2所示，與SLA對照組相比，SLA-0.2、SLA-1和SLA-5組表面的水接觸角明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義。說明載FP鈦表面親水性更強，且SLA-5組水接觸角<10°，為超親水表面，這可能是由于硅烷化處理后表面形成大量的羥基。

*：P<0.05

2.3 蛋白吸附

SLA、SLA-0.2、SLA-1和SLA-5組表面蛋白吸附量分別為(0.052 4±0.003 8)、(0.076 5±0.003 9)、(0.089 5±0.003 7)、(0.085 1±0.002 4)mg。SLA-0.2、SLA-1和SLA-5組對蛋白質的吸附能力顯著高于SLA組(P<0.05)。

2.4 細胞黏附形態(tài)

圖3為MC3T3-E1細胞在材料表面培養(yǎng)4 h后的黏附與鋪展情況。SLA組黏附細胞較少，細胞較為皺縮，SLA-0.2、SLA-1和SLA-5組表面均觀察到黏附了更多的細胞，細胞形態(tài)也更為鋪展，面積更大、偽足更多，其中SLA-1和SLA-5兩組與對照組的差異更為明顯。

A：SLA組；B：SLA-0.2組；C：SLA-1組；D：SLA-5組

2.5 細胞增殖活性

圖4為CCK-8檢測材料表面MC3T3-E1細胞的增殖情況。第1天，4組結果相近，差異無統(tǒng)計學意義。第3、5天，SLA-1和SLA-5組細胞增殖明顯高于SLA組(P<0.05)，SLA-0.2組僅在第5天高于SLA組。

*：P<0.05

2.6 菌落形成單位和抑菌率

圖5A為各組材料平板菌落計數(shù)的結果，按表面活菌菌落數(shù)量多少排列為SLA組>SLA-0.2組>SLA-1組>SLA-5組。以SLA組作為對照，計算SLA-0.2組、SLA-1組和SLA-5組的抑菌率，分別為74.33%±3.92%、93.75%±1.48%和100.00%。如圖5B所示，SLA-1和SLA-5組的抑菌率顯著高于SLA-0.2組(P<0.05)。

A：4組樣品表面的活菌菌落數(shù)；B：4組材料表面的抑菌率；*：組間差異統(tǒng)計學意義，P<0.05

3 討 論

抗菌肽BMAP-27、LF1-11等被證明固定在固體載體上也具有強大的滅菌活性[18-19]，通過共價結合連接到鈦片上，這種連接對其抗菌性能沒有顯著影響[20-21]。在本研究中，對處理步驟進行了改進，SLA鈦片先用氫氧化鈉堿熱處理，獲得Ti—OH表面，然后用CPTES對鈦表面進行硅烷化處理，隨后與肽N-端上的氨基反應，獲得共價結合。為了驗證功能化過程是否成功，通過XPS對鈦樣品進行了表征。正如預期的那樣，實驗組樣品中硅的存在以及碳和氮含量的增加支持樣品被成功硅烷化。相對于SLA組，實驗組樣品中碳和氮的含量增加，氧和鈦的百分含量降低，表明多肽分子在硅烷化的金屬表面上附著穩(wěn)定，從而證實了FP鏈接到鈦表面的步驟是合理可靠的。

種植體植入體內(nèi)后，水和無機鹽率先到達種植體表面，然后蛋白質介導細胞與種植體之間的黏附[22]。因此，細胞在材料表面的附著和增殖與材料的親水性和蛋白質吸附能力密切相關。結果表明，實驗組的親水性顯著提高，對蛋白質的吸附能力也明顯增強，同時MC3T3-E1細胞在實驗組表面的增殖活性更高，細胞也更為鋪展，表明載FP鈦表面具有良好的生物相容性，對MC3T3-E1細胞無細胞毒性作用，其中1 mg/mL組的結果最好。

種植體的早期感染通常由手術部位的S.aureus等病原體引起[23-24]，故本實驗選用S.aureus作為實驗菌來檢測材料的抗菌性。阻止細菌在種植體表面的初始黏附是防止生物膜形成的關鍵。有研究表明，生物膜中細菌對抗生素的耐藥性是浮游細菌的10～1 000倍[25]。實驗結果表明，載FP鈦表面對細菌有良好的殺滅效果，抑制其生長和繁殖，與負載的FP濃度成正相關，5 mg/mL組表現(xiàn)出最佳的抗菌效果，高達100.00%。

在本研究中，我們通過硅烷化制備載FP的多孔鈦表面，研究了其生物相容性和抗菌活性。然而，AMPs是由天然免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的多肽，除了具有抗菌作用外，還具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)特性[26-27]，有待進一步研究載FP鈦表面對炎癥反應和破骨細胞生成的影響，并探討可能的作用機制。