唑來膦酸對大鼠頜面骨和外周骨創傷后骨改建的影響

龔 雪，錢文昊，蘇儉生

雙膦酸鹽(bisphosphonates，BPs)具有較強的抑制骨吸收作用，是目前臨床上應用最廣泛的一線抗骨質疏松藥物。它可通過延緩骨破壞，提高骨礦物質密度，增強骨骼強度以及降低骨折發生率，極大地提高患者的生活質量。然而近年來臨床發現，長期應用BPs類藥物可引起雙膦酸鹽相關性頜骨壞死(bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw，BRONJ)等嚴重不良反應[1-4]，引發國內外學者廣泛關注。有流行病學資料顯示[5-7]：接受靜脈BPs類藥物治療的腫瘤患者，BRONJ的累計發病率為0.8%～12%；口服BPs類藥物治療的患者，BRONJ發病率較低，為0.01%～0.04%，但當加入拔牙等口腔侵入性治療這一危險因素后，發病率呈現數量級的提升。BRONJ多發生于拔牙等口腔外科治療后。60%～70%的BRONJ患者具有拔牙等創傷史，拔牙被認為是BRONJ發生的最重要的危險因素[8-9]，而伴有口腔炎性疾病在一定程度上又增加了罹患BRONJ的風險[10-12]。因此，口腔科醫師在給服用BPs類藥物的患者實施拔牙、牙周手術、牙植入、根尖手術等操作前需要仔細評估[13-14]。目前BRONJ無確切有效的臨床治療方法，僅限于保守治療，且傳統的治療方法如大劑量抗生素、死骨清創術以及高壓氧艙治療等對其療效并不理想[15-16]。上述治療方法的問題和局限性使我們必須重新考慮治療策略。因此，研究BPs導致的拔牙后頜骨壞死的致病機制和治療方法，顯得非常緊迫和必要。

BRONJ的致病機制迄今不明，多數學者認為拔牙等手術造成頜骨創傷后，BPs對破骨細胞產生的強大抑制作用導致頜骨骨改建受到過度抑制[17]。在正常骨組織中，成骨細胞和破骨細胞維持著一定的動態平衡，使得骨組織具有吸收重建功能。日常咀嚼等活動會對頜骨造成微創傷，但這種微創傷可通過骨內代謝完成自我修復。但BPs嚴重抑制了骨改建，從而導致拔牙窩周圍骨組織重建失敗，引發頜骨壞死。但這不能解釋一個關鍵問題，為什么目前所報道的BRONJ多發生于顱頜面骨，未見發生于外周骨。從胚胎來源看，顱頜面骨起源于外胚間葉組織，主要為膜內成骨；外周骨起源于中胚層，骨發生形式為膜內成骨伴隨軟骨內成骨[18-19]。顱頜面骨和外周骨創傷重建過程中，破骨所需的細胞均來源于造血系統的單核巨噬細胞系，但成骨所需的細胞來源于各自局部組織內的骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)。顱頜面骨和外周骨來源的BMSCs在增殖、誘導活性等方面具有不同的特性[20]。骨的重建由骨的生成和吸收構成，成骨細胞和破骨細胞的動態平衡是維持正常骨量的關鍵。

目前，關于BRONJ發病機制的研究主要集中在BPs對破骨細胞的作用，BPs作用下顱頜面骨和外周骨創傷修復能力差異不甚清楚。本實驗從骨組織位點特異性角度出發，采用頜骨拔牙和脛骨制備骨創傷，觀察第3代BPs代表藥物唑來膦酸對大鼠頜骨與外周骨創傷后骨改建的影響，為探索BRONJ發病機制提供一個新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8～10周齡SPF級雌性Sprague-Dawley大鼠，體質量200～250 g，由上海市斯萊克實驗動物中心提供。

1.2 試劑和儀器

唑來膦酸、蛋白酶抑制劑(Sigma，美國)；水合氯醛、利多卡因、多聚甲醛、EDTA、二甲苯、乙醇、石蠟(上海國藥，中國)；蘇木精-伊紅染色試劑盒(南京建成，中國)；Masson染色試劑盒(凱基生物，中國)；大鼠RANKL ELISA試劑盒，大鼠OPG ELISA試劑盒(武漢中美，中國)；BCA蛋白檢測試劑盒(康為生物，中國)；石蠟包埋機、石蠟切片機、石蠟展片機、石蠟烘片機、微電子計算機斷層掃描(Leica，德國)；倒置相差顯微鏡(Nikon，日本)；移液器(Eppendorf，德國)；離心機、洗板機(Thermo，美國)；酶標儀(Tecan，瑞士)。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠頜骨和外周骨創傷的建立 大鼠隨機分為實驗組和對照組，每組36只。實驗組每周尾靜脈注射唑來膦酸(80 μg/kg)，對照組注射等劑量磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline，PBS)。用藥兩周后，在腹腔注射全身麻醉以及局部浸潤麻醉下，牙齦分離器分離牙齦，微創拔除一側上頜第一磨牙(圖1A)，并用紗布壓迫止血。同時在同側脛骨近心端切開皮膚，鈍性分離組織，暴露脛骨上端，在生理鹽水冷卻下于膝關節下約2～3 mm處用慢速手機制備骨缺損(圖1A)，然后用紗布壓迫止血后復位組織，縫合創口。術后肌注青霉素(500 000 U/kg)3 d以防止感染。之后繼續用藥，至術后1周、4周、12周，大鼠分批處死后，分離并收集頜骨和脛骨組織。

A：大鼠頜骨拔牙創；B：大鼠脛骨骨缺損；藍色橢圓表示骨缺損部位

1.3.2 Micro-CT檢測 分離和收集的骨組織樣本進行Micro-CT檢測，分析各組骨缺損區新骨形成情況。掃描參數設置為電壓45 kV，電流550 μA，分辨率10 μm。掃描完成后，利用Dateviewer Pro和CTvol Software分析處理骨體積(bone volume，BV)、總體積(total volume，TV)和骨體積分數(BV/TV)數據。

1.3.3 組織學檢測 收集的骨組織樣本PBS沖洗干凈后，在4 ℃下經4%多聚甲醛固定完全后沖水過夜，然后用10% EDTA在室溫下脫鈣，每3 d更換脫鈣液至樣本變軟，以注射針頭輕松刺入為準。沖水過夜后，用脫水機乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟，包埋機石蠟包埋后，以5 μm的厚度切片、展片、烘片，進行HE和Masson染色。

1.3.4 骨組織中RANKL、OPG測定 將原缺損區域的骨組織即刻放入液氮進行低溫冷凍，待所有樣本收集完畢后，用滅菌后的研缽對冷凍的骨組織進行充分研磨。用T-PER試劑進行組織裂解，離心后得到組織裂解液。按照ELISA試劑盒說明定量檢測樣本RANKL、OPG含量。考慮到不同骨組織樣本中細胞數目不同對總的RANKL、OPG含量產生影響，我們檢測了總蛋白含量來對其含量進行標準化處理。

1.4 統計學分析

以上所有定量數據以平均值±標準差形式呈現，使用SPSS 16.0軟件包采用獨立樣本t檢驗分析組間差異，P<0.05表示具有統計學意義。

2 結 果

2.1 Micro-CT掃描分析

Micro-CT三維重建后各組樣本的矢狀切面圖如圖2。拔牙后4周，實驗組拔牙創表面高低不平，中央有淺碟狀凹陷，可見游離的死骨片；對照組拔牙創可見新骨生成，已觀察不到明顯的缺損邊界，但新骨形成表面較不平整。拔牙后12周，實驗組拔牙創與4周時基本相似，表面仍高低不平，中部淺凹處有大量的游離死骨片，骨壞死呈現加劇趨勢；對照組新骨形成區域與周邊骨質均勻連接，骨改建已基本完成。術后4周，實驗組脛骨骨缺損基本愈合，只是表面較不平整，骨皮質明顯較對照組增厚，新骨生成亦較對照組活躍，松質骨內充盈著大量新生骨，形態規則，排列緊密；而對照組骨松質內的新生骨則較稀疏。術后12周，實驗組脛骨缺損區骨皮質完整連續，較對照組厚且致密，骨改建已基本完成，骨松質內的新生骨亦明顯較對照組排列緊密。

圖2 術后大鼠頜骨和脛骨Micro-CT矢狀切面圖

各組樣本術后BV/TV分析結果如表1。術后4周和12周，實驗組脛骨BV/TV比值較對照組明顯上升(P<0.05)，實驗組頜骨BV/TV比值較對照組差異無統計學意義。

表1 骨體積分數BV/TV分析

2.2 組織學結果

組織學染色結果如圖3～5。拔牙后4周，實驗組拔牙創仍未愈合，創區黏膜潰爛，可見骨面暴露，死骨形成。在高倍鏡下，病變骨質中骨細胞細胞核固縮或缺失，出現許多空的骨陷窩，而骨小梁排列緊密、增生明顯，骨質出現不同程度的硬化，且周圍伴有大量的炎性細胞浸潤，為典型的BRONJ組織病理表現。對照組拔牙創已愈合，上皮組織已經完全覆蓋創面。在高倍鏡下，可見大量形態規則的骨小梁結構生成，開始了正常的生理性骨改建。拔牙后12周，實驗組部分樣本拔牙創表層雖有上皮組織覆蓋，但在高倍鏡下，骨壞死卻呈現加劇趨勢，空骨陷窩明顯增多，死骨面積增大，壞死骨周圍炎癥浸潤亦更為嚴重。對照組上皮組織完全覆蓋創面，上皮下骨組織均勻連續，骨改建已基本完成。

B：骨組織；NB：壞死骨；IF：炎性細胞浸潤；CT：結締組織；E：上皮

術后4周，實驗組脛骨骨缺損都已愈合，骨創處骨皮質外圍有增生的纖維結締組織包繞。實驗組骨皮質明顯較對照組增厚，可見較多散在呈紅色的新骨生成(如圖5紅色箭頭示)，新骨生成較對照組活躍。實驗組松質骨內充盈著大量新生骨小梁，形態規則，排列緊密，而對照組骨松質內的骨小梁則較稀疏。術后12周，實驗組脛骨缺損區骨皮質完整連續，較對照組厚且致密，骨改建已基本完成，而對照組中還可見少量紅色新骨(如圖5紅色箭頭示)，骨改建速度較慢。

B：骨組織；NB：壞死骨；IF：炎性細胞浸潤；CT：結締組織；紅色箭頭所示紅色區域為新生骨

2.3 細胞因子檢測

RANKL和OPG表達結果如表2。術后4周和12周，實驗組頜骨和脛骨OPG表達均較各對照組輕度上升，但差異無統計學意義。術后4周和12周，實驗組頜骨RANKL表達較對照組輕度下降，但差異無統計學意義。實驗組脛骨RANKL表達較對照組上升(P<0.05)。術后4周和12周，實驗組頜骨RANKL/OPG比值較對照組明顯下降(P<0.05)，實驗組脛骨RANKL/OPG比值較對照組明顯上升(P<0.05)。

表2 RANKL、OPG表達和RANKL/OPG 含量比值

3 討 論

唑來膦酸是第三代含氮雜環BPs，其咪唑側鏈上含有2個氮原子，與骨組織中的羥基磷灰石親和力高，可與骨組織牢固地結合，發揮抑制骨吸收作用，是目前臨床上應用最為廣泛、抗骨質吸收能力最強的BPs。本研究從骨組織位點特異性角度，應用第三代BPs代表藥唑來膦酸對大鼠進行尾靜脈注射，頜骨拔牙以及外周骨脛骨制備骨缺損，來研究唑來膦酸對大鼠頜骨和外周骨創傷后骨改建的影響。

本實驗組織學染色顯示，實驗組拔牙創黏膜未愈合或延遲愈合，未愈合的黏膜下方可見骨面暴露、骨壞死，病變骨質中可見許多空的骨陷窩，而骨質出現不同程度的硬化，且周圍伴有大量的炎性細胞浸潤，為典型的BRONJ組織病理表現。對照組頜骨拔牙創4周內上皮組織已經完全覆蓋創面，缺損區大量形態規則的骨小梁結構生成，進行了正常的生理性骨改建。實驗組脛骨骨缺損在術后4周基本愈合，骨創處骨皮質厚且致密，松質骨內新生骨小梁密集，新骨生成活躍。而對照組骨皮質較薄，骨松質內骨小梁稀疏，新骨生成和骨改建速度較慢。可見，唑來膦酸對頜骨拔牙創傷后的骨改建起到明顯的抑制作用，可以引起大鼠頜骨BRONJ樣病變；而對外周骨脛骨骨創傷后的骨改建卻起到一定的促進作用，可以較快地修復骨創傷，且未發生類似于頜骨骨壞死的現象。與目前文獻報道的BPs引發骨組織壞死多發生于頜骨，未發生于外周骨的臨床流行病學資料一致。

B：骨組織；NB：壞死骨；IF：炎性細胞浸潤；CT：結締組織

BPs引起的骨組織改變是全身性的，對骨組織影響廣泛。病理結果顯示，頜骨骨壞死均發生于拔牙窩附近，遠端的骨質未涉及，且死骨周圍多伴有大量的炎性細胞浸潤，這一結果提示我們牙槽創傷是引發BRONJ的重要危險因素，而感染因素在BRONJ病程進展中亦起一定的作用。唑來膦酸對外周骨的作用，不僅對創傷處骨改建起一定促進作用，未發生類似頜骨壞死的現象，且還涉及非創傷處的遠端骨質，骨皮質和骨松質都有一定程度的增生。

RANKL/RANK/OPG系統在調控骨吸收與骨生成動態平衡，保證正常的骨更新中起著重要作用[21]。RANKL主要位于成骨前體細胞表面，亦可表達于BMSCs等細胞的表面，可與破骨前體細胞和成熟破骨細胞表面表達的受體RANK結合，促進破骨前體細胞分化和成熟，并抑制破骨細胞凋亡，增強骨吸收。OPG表達于成骨前體細胞等的表面，可競爭性地與RANKL結合，阻斷RANKL與破骨細胞表面RANK結合，抑制破骨前體細胞分化、成熟并誘導破骨細胞凋亡，從而抑制骨吸收。破骨細胞的數量和活性在RANKL/OPG比值上調時將增加，在比值下降時將降低。正常的骨重建和骨量的穩定依賴于RANKL和OPG的平衡。本實驗中，實驗組頜骨RANKL/OPG比值明顯下降，而實驗組脛骨RANKL/OPG比值明顯上升。由此提示，唑來膦酸可通過調節成骨前體細胞表面RANKL/OPG等基因的表達來抑制破骨細胞的分化和功能，從而抑制創傷后骨表層破骨細胞的溶骨性活動。骨吸收和骨生成之間的平衡被破壞，致使拔牙窩周圍骨重建過程受抑制，拔牙創經久不愈，引發頜骨壞死。而唑來膦酸對外周骨骨改建的影響恰好相反，RANKL/OPG比值上調，破骨細胞的溶骨性活動增強，在外周骨發生創傷后進行了活躍的骨改建，骨皮質較對照組厚且致密，骨松質新生骨小梁亦較對照組排列緊密。這可能是BRONJ常發生于頜骨而不是外周骨的重要原因之一。