Tideglusib對LPS刺激的人根尖牙乳頭干細胞牙/骨向分化的影響

蔣 玫，張悅蓉，沈天暉，張光東

根尖周炎是由齲病或外傷等多種因素引起的一種常見口腔疾病[1]，大多是牙髓微生物感染導致根尖周組織炎癥及骨破壞[2]。根管治療術是治療牙髓或根尖周疾病的最佳方案[3]。但是，當年輕恒牙發生根尖周炎時，牙根無法正常發育，導致根尖孔敞開，降低患牙的存留率[4-5]。因此，治療年輕恒牙的重點應是控制感染和形成根尖封閉。

以干細胞為基礎的再生治療使得年輕根尖周病變患牙根尖愈合成為可能。目前，年輕恒牙根尖周病變最常用的治療方法是用氫氧化鈣糊劑或三氧化礦物聚集物(mineral trioxide aggregate, MTA)結合根尖屏障術或根尖誘導成形術來控制感染，實現根尖閉合[4-5]。來自年輕恒牙的根尖牙乳頭干細胞(stem cells from the apical papilla, SCAPs)是一種牙源性間充質干細胞，具有自我更新能力、高增殖潛能和低免疫原性[6]。大量證據表明，SCAPs能夠分化為多種細胞系，如成骨細胞、成牙本質細胞、軟骨細胞和肝細胞等，有望成為一種干細胞治療來源[7-8]。研究表明，SCAPs可從長期暴露于炎癥環境的年輕恒牙中分離出來，但其增殖能力和牙/骨向分化潛能均低于健康的牙乳頭細胞[9]。

Tideglusib是目前主要用于治療阿爾茨海默病的藥物，它為糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的一種不可逆、非ATP競爭的抑制劑[10-13]。GSK-3β的一個重要作用是在體內調節干細胞[14]。作為炎癥反應的主要調節因子，GSK-3β通過激活Toll樣受體從而刺激促炎細胞因子包括IL-6、IL-8、TNF-α等的產生[15]，而此類細胞因子刺激與根尖周炎癥相關的骨吸收[16]。有研究表明，GSK-3β作為破骨細胞分化的負調控因子，在破骨細胞形成過程中發揮著重要作用[17-18]。Sun等[19]證實，GSK-3β表達增強和GSK-3β激酶活性增加在根尖周疾病的發生發展中很重要，推測GSK-3β抑制劑對根尖周疾病有治療作用。近年來，英國學者Sharper教授團隊發現治療用于治療阿爾茨海默病的Tideglusib成功誘導小鼠自然修復牙本質形成，在小鼠和大鼠磨牙髓腔中產生的修復性牙本質完全修復了病變缺損，其礦物質含量和組成與正常牙本質相似[20-21]，但其機制還有待進一步研究。

本研究擬通過細胞培養、流式細胞術、實時定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction, RT-qPCR)及Western blot等實驗方法，研究Tideglusib對脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的SCAPs牙/骨向分化能力的影響，為年輕恒牙根尖周炎的治療提供參考及新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Tideglusib(MCE, hy14872，美國)，LPS(Sigma,L2630，美國)，基本培養液 α-MEM(Gibco，美國)，胎牛血清(Gibco,美國)，磷酸鹽緩沖液(PBS，Hyclone，美國)，雙抗(Gibco,美國)，胰蛋白酶(Gibco,美國)，Ⅰ型膠原酶(Sigma,美國)，SDS-PAGE 凝膠試劑盒(碧云天，中國)，蛋白Marker(Fermentas,美國)，抗核心結合蛋白因子-2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)抗體、抗牙本質涎蛋白(dentin sialoprotein, DSP)抗體、抗成骨細胞特異性轉錄因子(osterix，OSX)抗體、抗骨鈣素(osteocalcin,OCN)抗體、抗Ⅰ型膠原(type Ⅰ collagen，COL-Ⅰ)抗體、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(Abcam，美國)，CCK-8 試劑盒(Dojindo，日本)，堿性磷酸酶染色試劑盒(碧云天，中國)，堿性磷酸酶檢測試劑盒(南京建成公司，中國)，RNA 提取試劑盒(Bioteke，中國)，酶標儀ELx800(BioTek instruments sinc,美國)，微孔板分光光度計(MD,美國)，化學發光凝膠成像系(GE,美國)，流式細胞儀(BD,美國)，ABI 7500real-time PCR system(ABI，美國)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 SCAPs原代培養 于2019年12月—2021年6月選取本院口腔頜面外科14～22歲無齲、無牙周炎患者的因阻生或正畸原因拔除的磨牙或前磨牙(南京醫科大學附屬江蘇省口腔醫院倫理審核編號-PJ2020-116-001)。用含有1%雙抗的PBS沖洗2次，然后用手術剪在超凈臺中取下根尖牙乳頭，在α-MEM中剪碎組織，加入500 μL 3 mg/mL Ⅰ型膠原酶和200 μL 4 mg/mL胰酶，在37 ℃及5% CO2條件下孵育消化20 min。加入完全培養基即含有10% FBS的α-MEM 培養液終止消化。帶組織塊的單細胞懸液在1 000 r/min下離心5 min后，棄上清，重懸于完全培養液中后接種于培養皿中，于37 ℃及5% CO2孵箱中培養細胞，每3～4 d換液。當細胞達到80%融合時，胰蛋白酶消化傳代。本研究采用生長狀況優良的2代SCAPs。

1.2.2 SCAPs的表面分子鑒定 使用流式細胞儀鑒定SCAPs表面抗原。將SCAPs常規進行胰酶消化，經過離心重懸后，稀釋細胞，后置于EP管內。各管中分別加入熒光標記抗體CD29、CD73、CD105、CD34、CD45，空白對照組僅有細胞懸濁液，4 ℃條件下避光孵育1 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS 洗，于200 μL PBS中重懸，使用流式細胞儀檢測。

1.2.3 CCK-8實驗 以2 000個細胞/孔的密度在96孔板中鋪細胞。用CCK-8試劑檢測Tideglusib對細胞增殖是否有影響。Tideglusib的濃度梯度為0、10、50、100、200 nmol/L，每個濃度梯度設置5個復孔。應用CCK-8試劑于第0、1、3、5、7、9天，37 ℃孵育2 h、450 nm波長下測定吸光度值。

1.2.4 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及ALP活性測定 將SCAPs置于由完全培養基、50 mg/L β-甘油酸磷酸鈉、10 nmol/L磷酸抗壞血酸和10 nmol/L地塞米松組成的成骨誘導培養基中培養，每2～3 d換液，直至第7天。多聚甲醛固定30 min，用ALP染色試劑盒在37 ℃下染色5～30 min，掃描儀下拍攝及顯微鏡觀察細胞形態。同樣，成骨誘導7 d后，用含1%蛋白酶抑制劑PMSF的RIPA裂解液裂解SCAPs，根據ALP檢測試劑盒檢測細胞ALP活性。用酶標儀在520 nm波長處測定吸光度。

1.2.5 RT-qPCR 實驗分為空白對照組、加LPS組、加入LPS和Tideglusib三組。細胞培養7 d后，根據說明書用RNA提取試劑盒提取各組總RNA。然后使用PCR儀進行檢測。引物序列見表1。選擇GAPDH作為內參基因，將靶基因(OSX、OCN、COL-Ⅰ、DSPP、RUNX2)的相對數量標準化，采用“ΔΔCt”法計算數據。

表1 本部分實驗所用引物序列

1.2.6 Western blot SCAPs用含Tideglusib的成骨誘導液培養7 d后，用1%PMSF的RIPA裂解細胞，超聲振蕩后，12 000 r/min 4 ℃下離心裂解后的細胞15 min，提取總蛋白。配制10%分離膠、4%濃縮膠和電泳緩沖液。每個泳道加入10～15 μL蛋白后，調試60 V恒壓電泳用于濃縮膠，90 V恒壓電泳用于分離膠。轉膜前用甲醇浸泡PVDF膜30 s，使其活化，將活化的膜對齊覆蓋在膠上一起放入電轉儀，以300 mA恒流電轉(電轉時間根據蛋白指標分子量而確定，平均1分子量電轉1 min)。含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液用于封閉膜，在搖床上緩慢振搖2 h后，將膜封入1∶1 000稀釋好的一抗，4 ℃過夜。次日，將 PVDF 膜放入配制好的二抗(8 mL TBST中加入山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG二抗各1 μL)，室溫下孵育1 h。最后，采用Western blot成像系統對膜進行成像，用Image J軟件對條帶進行定量分析。

1.3 統計學方法

所有實驗重復3次。采用GraphPad Prism 8統計軟件進行統計分析，不同組間的差異使用單因素方差分析或Studentt檢驗。對于兩組以上的比較,使用Tukey′s或Dunnett′s事后檢驗的單因素方差分析(ANOVA)。統計學顯著性水平設為α=0.05。

2 結 果

2.1 SCAPs的分離與培養

取年輕恒牙根尖牙乳頭(圖1A)，酶消化法提取原代細胞，培養約3 d后觀察到貼壁細胞，呈長梭形排列(圖1B)。

A：年輕恒牙根尖牙乳頭；B：SCAPs原代細胞

2.2 SCAPs的鑒定

流式細胞術結果顯示，SCAPs間充質干細胞標記物CD29、CD73、CD105表達陽性(陽性細胞比率分別為94.5%、81.5%、54.5%)，而造血干細胞標記物CD34、CD45表達陰性(陽性細胞比率 CD45為9.74%，CD34為16.8%)(圖2)。成功提取SCAPs。

圖2 SCAPs表面抗原鑒定結果

2.3 CCK-8檢測細胞增殖

Tideglusib分子式如下(圖3A)。CCK-8結果顯示，當Tideglusib的濃度低于50 nmol/L時對SCAPs細胞增殖無明顯抑制(圖3B)。

A：Tideglusib分子式；B：CCK-8檢測結果，與0 nmol/L組比較，**：P<0.05，***：P<0.01，****：P<0.001

2.4 篩選Tideglusib的最佳濃度

調整濃度梯度后，將SCAPs與10 μg/mL LPS 共培養，通過ALP染色(圖4A)和ALP活性(圖4B)實驗證明，僅加入10 μg/mL LPS SCAPs組相較于空白對照組ALP表達明顯降低，并篩選出在10 μg/mL LPS 條件下Tideglusib促進SCAPs ALP表達的最佳濃度為1 nmol/L。

A：ALP染色結果(比例尺=200 μm)；B：ALP活性檢測結果,****：P<0.001

2.5 Tideglusib對炎癥環境下SCAPs牙/骨向分化相關蛋白表達的影響

在成骨誘導培養基中培養SCAPs。細胞培養7 d后，Western blot檢測各組細胞中與成牙本質分化和成骨分化相關的蛋白(OSX、OCN、COL-Ⅰ、DSP、RUNX2)的表達。結果顯示，LPS組的成牙/成骨相關蛋白表達下降，與LPS組相比，Tideglusib組相關蛋白表達升高(圖5)。

A：Western blot 結果，GAPDH 作為內參；B：ImageJ 分析目的條帶，**：P<0.05，***：P<0.01，****：P<0.001

2.6 Tideglusib對炎癥環境下SCAPs牙/骨向分化相關基因表達的影響

在成骨誘導培養基中培養SCAPs。細胞培養7 d后，RT-qPCR檢測各組細胞中與成牙本質分化和成骨分化相關的基因(OSX、OCN、COL-Ⅰ、DSPP、RUNX2)的表達。結果顯示，LPS組的成牙/成骨相關基因表達下降，與LPS組相比，Tideglusib組相關基因表達升高(圖6)。

**：P<0.05,***：P<0.01,****：P<0.001

3 討 論

當代口腔醫學認為，組織再生(包括控制感染和誘導根尖持續生長)對年輕恒牙根尖周炎癥的預后優于根尖手術和傳統的根管治療[22]。發生根尖周炎的年輕恒牙常由于非生理性冠根比(crown-to-root ratio, CRR)，存在遠期的術后并發癥，如根折或牙齒松動。因此，本研究希望探索出一種能夠促進炎性根尖周組織再生的藥物，使年輕恒牙發生根尖周炎時，其牙根還能繼續發育。

LPS為革蘭氏陰性菌外膜的主要成分[23]，是一種強效的毒力因子，在成牙本質細胞、成纖維細胞和牙髓細胞中引起多種免疫反應。研究表明，革蘭氏陰性菌是壞死牙髓中最常見的微生物[24]，而LPS誘導的細胞因子和趨化因子持續存在于牙髓及SCAPs中，參與免疫反應和組織降解[25]。此外，在其他牙源性干細胞如牙髓干細胞和牙周膜干細胞中，也報道了LPS刺激導致成骨相關基因表達及細胞增殖的改變[25-27]。LPS被認為與牙根的發育相關，來源于大腸桿菌而不是牙齦卟啉單胞菌的LPS誘導細胞因子和趨化因子的表達[28]。Huang等[29-30]研究表明，LPS可用于牙周膜干細胞，用以模擬體外炎癥環境。因此，本研究選取大腸桿菌LPS進行后續實驗。LPS對牙源性干細胞的細胞增殖和成骨分化的影響顯示為增強、抑制或不影響取決于干細胞和LPS的來源以及LPS的濃度[31-32]。有報道稱，1 μg/mL的LPS可以保護間充質干細胞，防止細胞凋亡并促進細胞增殖，而高劑量的LPS則會在體外增加間充質干細胞的凋亡[33]。以往文獻利用10 μg/mL的LPS，通過測定成骨相關指標及炎性因子等的表達，構建牙周膜干細胞及牙髓干細胞的體外炎癥模型[34-35]。因此，本實驗選取的LPS濃度為10 μg/mL，LPS刺激SCAPs 1周后，通過ALP染色、ALP活性、Western blot和RT-qPCR實驗證實了細胞ALP表達及牙/骨向分化相關基因和蛋白(OSX/OSX、OCN/OCN、COL-Ⅰ/COL-Ⅰ、DSPP/DSP、RUNX2/RUNX2)的表達下降，礦化能力降低，與以往的研究結果一致。

近年來，相關研究成功應用GSK-3拮抗劑促進牙本質再生，它通過激活牙髓干細胞來刺激修復性牙本質的自然形成。Tideglusib是FDA批準的GSK-3β抑制劑,因促成牙/成骨作用而在口腔醫學領域受到關注[20-21,36]。Marianne等首次證明Tideglusib通過抑制GSK-3β促進成骨分化[37]。也有研究表明Tideglusib能夠以凝膠形式通過Wnt/β-catenin信號通路促進牙髓干細胞的成牙本質向分化[36]。Wnt/β-catenin信號通路在成骨分化中起重要作用[37]。而目前尚未有Tideglusib對炎性根尖周組織是否存在促進牙/骨向分化作用的相關研究。

ALP在羥基磷灰石晶體的形成中起重要作用，羥基磷灰石晶體在成骨細胞和成牙本質細胞礦化初期不可或缺，其活性在早期鈣化過程中上調[38]。因此，ALP在許多研究中被用作牙/骨向分化的早期標記物[39-40]。本實驗通過檢測細胞在第7天的ALP活性結果顯示，Tideglusib促進LPS刺激SCAPs分化的最佳濃度為1 nmol/L。CCK-8實驗也表明，1 nmol/L的濃度不影響SCAPs細胞增殖。然而，有關Tideglusib在根尖周組織細胞的相關研究較少，其在不同條件下的最佳用藥濃度選擇仍需進一步探究。我們通過選擇不同階段牙/骨向分化的重要調控基因和蛋白(OSX/OSX、OCN/OCN、COL-Ⅰ/COL-Ⅰ、DSPP/DSP、RUNX2/RUNX2)[41-43]作為研究指標，發現Tideglusib對促進LPS刺激的SCAPs礦化的作用顯著，這是否是因為Tideglusib激活Wnt/β-catenin信號通路或有其他礦化相關信號通路參與作用，仍需要進一步的研究證實。

已有學者研究出一種膠原蛋白海綿，可供低劑量的小分子GSK-3拮抗劑附著，促進牙本質的自然恢復[20]。作為載體的海綿隨著時間的推移逐漸降解，牙本質占據海綿的空間，取代其實現了完整有效的自然修復。這為我們后續如何Tideglusib將應用于臨床提供了思路。

本研究初步證實了Tideglusib對于LPS刺激的SCAPs有促進其成牙/成骨向分化的作用，為年輕恒牙根尖周炎的治療提供了新的思路。而Tideglusib的具體作用機制，以及其成牙/成骨向分化與抗炎作用是否有相關性還需要進一步探究。